El alumno desarrollara en el laboratorio la técnica cualitativa para determinar la presencia de inhibidores microbianos en leche fluida. Introduccion




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fecha de publicación25.02.2016
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PRÁCTICA # 1

DETERMINACIÓN DE INHIBIDORES MICROBIANOS EN LECHE
M.C. MARIO REAL NAVARRO

Profesor de Toxicología

Departamento de Salud Publica

Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias

Universidad de Guadalajara

OBJETIVO

El alumno desarrollara en el laboratorio la técnica cualitativa para determinar la presencia de inhibidores microbianos en leche fluida.
INTRODUCCION.

Los antibióticos son sustancias de acción antimicrobiana producidas por microorganismos o plantas superiores en el curso de su metabolismo normal, son sustancias que inhiben de otros microorganismos en concentraciones mínimas.
De este modo, ciertas patologías que afectan exclusivamente a los animales y por tanto no son consideradas zoonosis, pueden llegar a serlo de forma indirecta, puesto que su presencia incrementa el riesgo potencial para la salud pública debido a la presencia significativa de inhibidores microbianos en alimentos para consumo humano, como consecuencia del uso masivo de antibióticos para promover el crecimiento, curar y prevenir enfermedades y promotor del crecimiento y el no respeto de los periodos de supresión. Existen inhibidores naturales de microorganismos en la leche aunque el combate se haga principalmente en base al uso de antibióticos.
INHIBIDORES NATURALES DE LA LECHE


NOMBRE

PROPIEDADES

Lactenina

Dos tipos, especialmente en calostro (poco activa en anaerobiosis); efecto menor en la leche

Inmunoglobulinas

Factor específico contra ciertos coliformes

Pseudoglobulinas


Inhibición de propionibacterias en suero

Hormonas




Ácidos grasos libres

Inhibición lactobacilos

Leucocitos

Fagocitosis



La cantidad de antibióticos que llega a la leche depende del tipo de preparado (componente activo y vehículo), dosis y forma de aplicación, producción de leche del animal tratado, tipo y grado de afección mamaria y tiempo que media entre el tratamiento y el ordeño.


CAUSAS DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PENICILINA EN LOS SUMINISTROS DE LECHE.


Errores de orientación y prácticas inadecuadas


42 %

  • incorrecta aplicación de recomendaciones

  • recomendaciones equivocadas

  • uso de ungüentos y substancias que contengan penicilina.

  • limpieza insuficiente de la máquina de ordeño




22 %

6 %

7 %

7 %

Comunicación y difusión insuficiente en el predio
Partos prematuros en el período seco
Adquisición de vacas tratadas con penicilina
Causas desconocidas
Total

42%
8%
3%
5%
100%


La administración ya sea oral, intramuscular o intravenosa, tiene menos importancia, desde el punto de vista de higiene de leche, que la aplicación por vía intramamaria. Esta última es la más usada para el tratamiento de la mastitis, dependiendo la cantidad de antibióticos eliminada por la leche del tipo de preparado, dosis, intervalos entre tratamiento y ordeño, número de ordeños, producción de leche y factores individuales.
Los preparados con base hidrofobia, presentan un tiempo de eliminación más prolongado que aquellos con base acuosa.
PUNTOS CRÍTICOS
Cuando se introduce un antibiótico en la ubre, éste se distribuye en el tejido mamario por los conductos galactóforos y es transferido al torrente sanguíneo por un mecanismo fisicoquímico que depende del valor de pKa (valor de disociación) del preparado, valor de pH del plasma sanguíneo, proteína ligada al antibiótico y valor de pH de la leche. Debido a esto, la reabsorción del producto es muy variable de acuerdo al preparado y al animal.
De la dosis administrada a la glándula mamaria, una parte es absorbida pasando al torrente sanguíneo, otra es inactivada por la leche y los productos generados por la infección y el resto, que es la mayor parte, es excreta da a la leche durante los ordeñas posteriores.
Existe una correlación negativa entre el tiempo de eliminación del antibiótico y el volumen de leche producido por el animal. Los animales de baja producción demoran en excretar el preparado, principalmente por la mala absorción y secreción de los cuartos afectados. El ordeño frecuente aumenta el efecto de dilución y por lo tanto acorta el tiempo de eliminación del antibiótico.
Por otra parte, no sólo la leche de los cuartos tratados es la que se contamina. Se ha podido comprobar, en algunos casos, actividad antibiótica en los cuartos vecinos no tratados, actividad que permanece, por lo general, durante un período de tiempo igual a la mitad del observado para los tratados. Es posible que esta situación se produzca por difusión pasiva entre la sangre y la leche y también por difusión directa entre los tejidos mamarios.
Debido a que los antibióticos de aplicación intramamaria son de fácil aplicación y generalmente baratos, dado que usualmente no se consulta al médico veterinario para su aplicación, se han hecho muy populares en las explotaciones lecheras y la consecuencia inmediata de esto es su reconocimiento como la principal causa de aparición de residuos de antibióticos en la leche.
IMPORTANCIA EN SALUD PÚBLICA
En la actualidad no se conocen informes sobre intoxicaciones provocadas por antibióticos de uso común ingeridos a través de la leche y se explica porque sus concentraciones resultan ser muy bajas como para provocar un efecto tóxico, con la excepción, posiblemente, del cloranfenicol, que es capaz de producir, de acuerdo a algunos investigadores, anemia plástica por depresión de la médula ósea, al suministrarse dosis bajas por períodos cortos de tiempo. No obstante lo anterior, subsiste la duda de si el consumo de antibióticos por el hombre, a través de alimentos contaminados, puede alcanzar niveles que determinen una toxicidad de tipo crónico, motivo más que suficiente para prohibir la presencia de éstos en los alimentos.
Otro de los problemas que ocasiona en el ser humano el antibiótico presente en la leche, lo constituyen las reacciones de tipo alérgico que se producen luego de un período de sensibilización, en el cual se generan en el sistema retículo endotelial anticuerpos contra la droga administrada que actúa como antígeno. El contacto con los antígenos, continuado o periódico, provoca la reacción alérgica que resulta desproporcionada con la dosis ingerida.
Además del problema de las reacciones alérgicas, los antibióticos presentes en la leche pueden provocar los siguientes efectos en el consumidor:


  • alteración de la flora intestinal,

  • estimulación de bacterias antibiótico-resistentes,

  • desarrollo de microorganismos patógenos, y . reducción de la síntesis de vitaminas.


Desde el punto de vista de la salud pública, el establecer límites máximos permisibles en cuanto a contenido de antibióticos en la leche resulta muy difícil y el uso de un límite inferior sólo debe considerarse como solución transitoria, siendo imperioso llevar a cabo mayores investigaciones en el tema.
Por lo anterior, la tendencia debe inclinarse hacia la limitación en el uso de estos preparados, por la vía de una adecuada selección genética, buen manejo del ganado, control sobre su utilización y principalmente, toda medida que contribuya a disminuir la incidencia de mastitis.
PROBLEMAS TECNOLOGICOS.
La producción de productos fermentados es la más afectada en la industria cuando en la leche recibida están presentes residuos de antibióticos, provocando grandes pérdidas en calidad y, por ende, económicas.
Por ejemplo, las bacterias empleadas en la fabricación de yoghurt, Lactobacillus vulgaricus y Streptococcus termophillus resultan ser unas de las más sensibles a los antibióticos. Las bacterias, por efecto de los antibióticos, presentan cambios morfológicos y pueden darse situaciones en que los cultivos iniciadores sean reemplazados por microorganismos indeseables, provocando la inutilización del producto o que se convierta en peligroso para su consumo.
Además de los efectos en los productos lácteos fermentados, la industria se ve perjudicada en pruebas de control de calidad a la que es sometida la leche a nivel de recepción. Tal es el caso del test de tiempo de reducción del azul de metileno, TRAM, que aumenta cuando la leche está contaminada con antibióticos, lo que trae como consecuencia un error en la clasificación de la leche.
Por otra parte, aún persiste la creencia errónea de que los tratamientos térmicos a que se somete la leche destruyen las sustancias inhibidoras y, en forma particular, los antibióticos. Sin embargo, un informe de 1967 de la Federación Internacional de la Lechería señala que la penicilina pierde solamente un 8% de su actividad luego de la pasteurización.

Un tratamiento térmico más exigente (90°C por 30 minutos), destruye el 20% de la actividad de la penicilina y la esterilización un 50%.
En el cuadro siguiente, se muestra un resumen con respecto a la termo estabilidad de los antibióticos frente a diferentes tratamientos.
TERMOESTABILIDAD DE ANTIBIOTICOS


Antibiótico

% de destrucción según el tratamiento térmico




Pasteurización

90°C / 30 min

100°C / 30min

Penicilina

8%

20%

50%

Estreptomicina

-

-

66

Neomicina

-

-

66

Clorotetraciclina

-

-

90

Oxitetraciclina

-

-

90

Cloranfenicol

-

-

-



PRINCIPALES EFECTOS PROVOCADOS POR LA PRESENCIA DE ANTIBIÓTICOS EN LOS PROCESOS INDUSTRIALES
Queso y productos fermentados


  • Demora en la acidificación

  • Demora en la coagulación

  • Coagulación deficiente

  • Disminución de la retención de agua

  • Desarrollo de microorganismos indeseables

  • Alteración de las características normales del producto:

    • cuerpo débil

    • textura blanda

    • sabor amargo (excesiva acción del cuajo)

    • consistencia arenosa (yogurt)

  • Interferencia en la formación de aroma en mantequilla fermentada.


En el siguiente cuadro se identifican algunos microorganismos lácticos y su sensibilidad a la penicilina, estreptomicina y clortetraciclina:



CULTIVO

Inhibición por Antibióticos

Penicilina

U.I. / ml

Estreptomicina

Gamas / ml

Clortetraciclina

Gamas / ml

parcial

total

parcial

total

parcial

Total

Strptococcus cremoris

0.05 – 0.17

0.1 – 0.5

-

-

-

-

Strtococcus. lactis

-

-

-

-

-

0.5

Streptococcus. thermophilus

0.0017 – 0.17

0.025 – 0.05

0.5 – 5.0

-

0.001 – 0.01

0.3

Lactobacillus acidophilus

0.3 – 0.6

0.1 – 0.3

-

-

-

0.3 – 0.5

Lactobacillus casei

0.3 – 0.6

0.05 – 5.0

-

-

-

0.05

Lactobacillus helveticus

0.3

-

0.1 – 0.5

-

-

-

Lactobacillus lactis

-

0.05 – 0.3

-

-

-

0.3 – 3.0

Cultivo Mantequilla

0.017 – 0.17

-

0.1 – 0.2

-

0.01 – 0.1

-

Cultivo inicial para quesos

0.20 – 0.05

0.2 – 0.50

0.04

-

0.02 – 0.025

-



MATERIAL


Equipo:

Bortex.

Baño mario a 80ºC

Estufa bacteriologica a 34ºC

Mechero

Pinzas de punta fina
Cristaleria:

Pipetas de 1 ml

Tubos de ensayo de 6 mL

Cajas petri
Consumibles:

Marcador indeleble

Discos de papel whatman de 6mm

Sensidiscos con penicilina a 0.01 UI p/disco

Solución buffer # 1

Medio de cultivo para antibiótico # 1
Biológico:

Bacilo Subtilis


PROCEDIMIENTO POR MUESTRA DE LECHE
1. Marcar dos tubos de ensayo F (Frió) y C (Caliente).

2. Colocar en cada uno de los tubos 1 mL de leche y 2 mL de solución Buffer.

3. Agitan en el bortex por 5 segundos.

4. EI tubo marcado con la C se lleva a baño María (80ºC) por 3 minutos posteriormente se deja enfriar a temperatura ambiente y se agitan nuevamente en el bortex.

5. EI tubo F se mantiene a temperatura ambiente.

6. En la caja petri con el medio de cultivo para antibiótico # 1 con Bacilo subtilis se colocan discos de papel whatman # 4 de 6mm humedecidos en el contenido de los tubos marcados con F y C respectivamente y en el centro de la caja se coloca el sensidisco con penicilina como referencia.

7. Introducir la caja de petri a la estufa bacteriana (34ºC) por 24 horas para su cultivo.
RESULTADOS

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
DISCUSION

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
CONCLUCIÓN

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Nombre del alumno: ___________________________________________________
Fecha: ______________________________________________________________
Firma: ______________________________________________________________

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