Tema I: Respuestas Celulares Ante el Estrés y las Agresiones por toxicos: Adaptacion, Lesion y Muerte




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títuloTema I: Respuestas Celulares Ante el Estrés y las Agresiones por toxicos: Adaptacion, Lesion y Muerte
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fecha de publicación10.03.2016
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7. Citología Vaginal Exfoliativa

Estudio de las células obtenidas por un ligero raspado de la vagina. Es la técnica más utilizada para detección precoz de cáncer de cuello uterino y para lesiones precancerosas. Se basa en el hecho de que las células de las capas superficiales del epitelio cervical se descaman continuamente. Otras indicaciones de esta técnica son: diagnóstico de infecciones genitales y valoración del nivel hormonal.

El factor de riesgo más importante para padecer cáncer de cérvix es la infección por el VPH, más probable si ha habido relaciones sexuales a muy temprana edad, número elevado de parejas sexuales, y relaciones sexuales con hombre no circuncidados. Otros factores de riesgo para padecer cáncer de cuello uterino son: fumar, infección por VIH, infección por Clamidia, alimentación pobre en frutas y verduras, ACO largo tiempo, embarazos múltiples, condición socioeconómica baja, exposición a Dietilbestrol antes de nacer y antecedentes familiares de cáncer de cuello de útero.
Instrucciones a la paciente previa a la citología:

  • Abstenerse de relaciones sexuales en las 48 horas previas a la toma.

  • Debe haber finalizado la menstruación 4-5 días antes.

  • Lavarse externamente con agua y jabón, no hacer lavados internos ni con desodorantes vaginales.

  • No usar tratamientos topicos en 5-7 días antes a la prueba (óvulos, espermicidas, cremas vaginales).


Procedimiento:

  • La mujer ha de estar colocada en posición ginecológica, procurando que esté relajada. Se separan con una mano los labios vulvares y se introduce el espéculo con la otra, en sentido longitudinal a la vulva.Se rota el espéculo 90º.Un vez introducido se abre hasta la completa visualización del cérvix, y se fija el espéculo.

  • Se hacen 3 tomas:

    • Fondo de saco vaginal posterior, con la parte semicircular de la espátula, luego se extiende sobre el porta, en la banda de la izquierda.

    • Toma de exocérvix, girando la espátula, en su parte lobulada, alrededor del cérvix, extendiendo la muestra en la parte central del porta.

    • Toma del endocérvix con la torunda o cepillo endocervical , una vez introducido en el orificio cervical, y extendemos la muestra en la banda derecha. Después se procede a la fijación de las tomas con spray, realizando la pulverización a 10 cm del porta.


Advertencias:

  • No hacer exploración bimanual antes de la toma, puede alterar el resultado.

  • En mujeres virgenes o introito vaginal estrecho, utilizaremos espéculo. virginal,podemos lubrificarlo con agua si es necesario. (Es poco frecuente la indicación de citología cervical en mujeres vírgenes).

  • No usar lubricantes por posible contaminación de la muestra.

  • Tras realizar la citología debemos advertir a la paciente que puede tener un pequeño sangrado, sin significación patológica.


Citología de Líquido Cefalorraquídeo

Es un grupo de pruebas de laboratorio para medir las proteínas, el azúcar (glucosa) y otros químicos en el líquido que rodea y protege el cerebro y la médula espinal.
Forma en que se realiza el examen

  • Se necesita una muestra del LCR. Una punción lumbar, también llamada punción raquídea, es la forma más común de recolectar esta muestra. Para obtener información sobre este procedimiento, ver el artículo sobre punción lumbar. Pocas veces se utilizan otros métodos para obtener la muestra del LCR, pero se pueden recomendar en algunos casos.

  • Extracción de LCR de una sonda ya puesta, como una derivación o un drenaje ventricular

  • Punción ventricular

  • Después de tomar la muestra, se envía a un laboratorio para su evaluación.


Razones por las que se realiza el examen

El análisis del LCR puede ayudar a detectar ciertas afecciones o enfermedades. Todo lo que aparece a continuación se puede medir, aunque no siempre se hace, en una muestra de líquido cefalorraquídeo:
Anticuerpos y ADN de virus comunes

  • Bacterias (incluyendo la que causa la sífilis, ver examen de VDRL)

  • Conteo de células

  • Cloruro

  • Antígeno criptocócico

  • Glucosa

  • Glutamina

  • Deshidrogenasa láctica

  • Bandas oligoclonales para buscar proteínas específicas

  • Proteína total

  • Si hay o no células cancerosas presentes


Valores normales

  • Anticuerpos y ADN de virus comunes: ninguno

  • Bacterias: ninguna proliferación de bacterias en un cultivo de laboratorio

  • Células cancerosas: ninguna presente

  • Conteo de células: menos de 5 glóbulos blancos (todos mononucleares) y 0 glóbulos rojos

  • Cloruro: 110 a 125 mEq/L

  • Hongos: ninguno

  • Glucosa: 50 a 80 mg/100 mL (o mayor a dos tercios del nivel de azúcar en la sangre)

  • Glutamina: 6 a 15 mg/dL

  • Deshidrogenasa láctica: menos de 2.0 a 7.2 U/mL

  • Bandas oligoclonales: 1 ó 0 bandas que no están presentes en una muestra de suero pareado

  • Proteína: 15 a 60 mg/100 dL

  • Nota: los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.


Significado de los resultados anormales

Un análisis anormal de LCR puede deberse a muchas causas, incluyendo:

  • Cáncer

  • Encefalitis (como la encefalitis del Nilo Occidental y la encefalitis equina del este)

  • Encefalopatía hepática

  • Infección

  • Inflamación

  • Síndrome de Reye

  • Meningitis debido a bacterias, hongo, tuberculosis o virus


Citología de Orina

Es un examen que se utiliza para detectar cáncer y enfermedades inflamatorias de las vías urinarias.
Forma en que se realiza el examen

Se necesita una muestra limpia de orina (mitad de la micción).
La muestra de orina también se puede recoger durante una evaluación del interior de la vejiga llamada cistoscopia.
La muestra de orina se procesa en un laboratorio y se examina bajo el microscopio por parte de un patólogo que busca células anormales.
Preparación para el examen

No se necesita ninguna preparación especial.
Lo que se siente durante el examen

La recolección de un muestra limpia de orina no produce ninguna molestia.
Razones por las que se realiza el examen

El examen se realiza para detectar cáncer y enfermedades inflamatorias de las vías urinarias. Con frecuencia se hace cuando se detecta sangre en la orina. También sirve para vigilar a un paciente con antecedentes de cáncer de las vías urinarias. El examen ocasionalmente se puede ordenar para individuos que tienen un alto riesgo de desarrollar cáncer de vejiga.
El examen también puede detectar la presencia de citomegalovirus y otras enfermedades virales.
Valores normales

La orina muestra células normales y está relativamente libre de residuos.
Nota: los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.
Significado de los resultados anormales

Las células anormales en la orina pueden ser un signo de inflamación de las vías urinarias o cáncer de riñón, uréteres, vejiga o uretra.
Consideraciones

El diagnóstico de cáncer o de enfermedad inflamatoria no se puede realizar exclusivamente por medio de este examen. Los resultados se confirman mediante otras pruebas o procedimientos diagnósticos. Una técnica llamada hibridación fluorescente in situ (HFIS) se puede usar para evaluar el material genético en las células eliminadas en la orina con el fin de detectar mejor los cánceres.
8. Concepto, indicaciones y utilidad de inmunoperoxidasa, inmunofluorescencia, hibridación molecular y citometria de flujo.

a. Inmunoperoxidasa: evidencia la presencia de Antígenos, mediante la reacción antígeno anticuerpo, en un procedimiento similar al de la inmunufluorescencia, pero utiliza la Peroxidasa como enzima unida al anticuerpo.

Se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas más frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamene al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o proteína A.
b. Inmunoflorescencia: es el etiquetado de anticuerpos o de antígenos con los tintes fluorescentes. Esta técnica es de uso frecuente visualizar la distribución subcelular de biomoléculas del interés. Las secciones o las culturas Inmunofluorescente-etiquetadas del tejido son estudiadas usando un microscopio de fluorescencia o por microscopia confocal. Lo más comúnmente posible, la inmunofluorescencia emplea dos conjuntos de anticuerpos: un anticuerpo primario se utiliza contra el antígeno del interés; se introduce un anticuerpo subsecuente, secundario, teñir-juntado que reconoce el anticuerpo primario. De este modo el investigador puede crear varios anticuerpos primarios que reconozcan los varios antígenos, pero, porque todos comparten una región constante común, puede ser reconocido por un solo anticuerpo teñir-juntado. Esto es hecho típicamente usando los anticuerpos hechos en diversa especie. Por ejemplo, un investigador pudo crear los anticuerpos en una cabra que reconocen varios antígenos, y después emplea los anticuerpos teñir-juntados del conejo que reconocen la región constante del anticuerpo de la cabra (anti-cabra denotada del conejo). Esto permite la reutilización de los anticuerpos teñir-juntados difícil-a-fabricación en experimentos múltiples. En algunos casos, es ventajoso utilizar los anticuerpos primarios etiquetados directamente con un fluoróforo. Este etiquetado directo disminuye el número de pasos de progresión en el procedimiento de coloración y, más importantemente, evita a menudo problemas de la reactividad cruzada y de alto fondo. El etiquetado fluorescente se puede realizar en menos de una hora con los kits de etiquetas fácilmente disponibles.
Aplicaciones de la inmunofluorescencia

Muchas aplicaciones de la inmunofluorescencia han sido anticuadas por el desarrollo de las proteínas recombinantes que contenían los dominios fluorescentes de la proteína, e.g. proteína fluorescente del verde (GFP). El uso de tales las proteínas “marcadas con etiqueta” permite una localización mucho mejor y menos interrupción de la función de la proteína. Las aplicaciones de la inmunofluorescencia incluyen: marcar las proteínas con etiqueta.
c. Hibridación Molecular: es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Esto hace que si irradiamos la muestra con la longitud de onda a la que absorben estas bases (260 nm), la absorción de energía será mucho menor si la cadena es doble que si se trata de la cadena sencilla, ya que en esta última los dobles enlaces de las bases nitrogenadas, que son las que captan la energía, están totalmente expuestos a la fuente emisora de energía.

Los nucleótidos se unirán con sus complementarios bajo condiciones normales: A=T; A=U; C≡G; G≡C; T=A ó U=A

Así que dos cadenas perfectamente complementarias se unirán la una a la otra rápidamente. Por el contrario, debido a las diferentes geometrías de los nucleótidos, una simple variación de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultará la unión.

El proceso de hibridación se puede revertir simplemente calentando la solución que contiene a la molécula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de alineamiento y de desnaturalización ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrógeno y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrógeno; por tanto, y dado que se requiere más energía para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energía se traduce en una mayor temperatura. El %GC no es igual para todas las especies, es más , el %GC es distinto incluso entre el ADN nuclear y el ADN mitocondrial, lo que nos da bastante juego en los protocolos de extracción de ADN, según que tipo vamos a estudiar y esto es importante, entre otros motivos porque existen enfermedades genéticas debidas a mutaciones en el ADN mit.

En biología molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de hibridación: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo northern, para uniones ADN-ARN.
d. Citometría de Flujo: es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Las células sanguíneas pueden analizarse prácticamente de manera directa, las células de tejidos sólidos deben primero dispersarse. Las células pueden hacerse pasar a muy altas velocidades (pueden llegar a alcanzarse velocidades cercanas a las 100,000 células por segundo).

Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con este causando dispersión de la luz, basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados.

El uso de moléculas fluorescentes distintas (distintos colores de fluorescencia) permite analizar la presencia de varios marcadores de manera simultánea.

Si el análisis incluye la detección de fluorencencia hablamos estrictamente de citofluorímetros de flujo (los conocidos como "citómetros" o "FACS" (por "Fluorescence-Activated Cell Sorter"). Los citómetros de flujo pueden analizar partículas en función de su fluorescencia y tamaño. Los conocidos como separadores o "sorters" pueden también purificar poblaciones de caracterísiticas determinadas.

Los aparatos de citometría de flujo pueden hacer análisis multiparamétrico, es decir, pueden combinar las medidas de distintos parámetros medidos sobre la misma célula y relacionarlos.
Aplicaciones

La tecnología tiene aplicaciones en un número de campos, incluyendo la biología molecular, la patología, la inmunología, la biología vegetal y la biología marina.

Es especialmente útil en el campo de la biología molecular cuando se usan anticuerpos etiquetados fluorescentemente. Estos anticuerpos específicos se unen a antígenos a las células diana y ayudan a dar información de las características específicas de las células rebuscadas en el citómetro. Tiene grandes aplicaciones en medicina (especialmente en trasplantes, hematología, inmunología de tumores y quimioterapia, genética y selección de esperma en IVF).

En la biología marina, las propiedades autofluorescentes del plancton fotosintético pueden ser explotadas por citometría de flujo para tal de caracterizar la abundancia y estructura de las comunidades marinas. En la ingeniería de proteínas, la citometría de flujo se usa conjuntamente con la exhibición de levadura y la exhibición bacteriana para identificar las variantes de proteínas exhibidas en membrana con las propiedades deseadas.
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