* Dra Cecilia Gabriela Cuffini, Prof. Adj. De, Dni: 20542159




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título* Dra Cecilia Gabriela Cuffini, Prof. Adj. De, Dni: 20542159
fecha de publicación05.08.2016
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PROYECTO PICTO- ANLIS 2011-0180
Título “Diversidad de Chlamydia psittaci aisladas de muestras de pacientes y aves con Psitacosis”
Categoria III
Grupo responsable:

* Dra Cecilia Gabriela Cuffini, Prof. Adj. DE, DNI:20542159

**** Magister Bioquímica Maria Estela Cadario, DNI 12126874

Investigador responsable del proyecto: Magister Bioquímica Maria Estela Cadario
Grupo colaborador:

**Dra Viviana Ré, Prof Adj SDE, DNI: 23299630

*Medica Ana Ximena Kiguen, Prof Asist DS, DNI: 28158378

*Bióloga María Celia Frutos, Prof ASist DS, Becaria SeCyT; DNI: 27423945

*Esp en Virol. Fernando Venezuela, Instructor docente, DNI: 27353753

*Biologa Marina Monetti, Agregada, (futura tesista), DNI: 30849826

***Analista universitario de sistemas Carlos Alonso, profesional invitado, DNI: 13374722

Instituciones:

*Laboratorio de chlamydias y virus Papiloma humano. Instituto de Virología Dr J.M.Vanella –ANLIS.

**Instituto de Virología Dr J.M.Vanella-FCM-UNC

***Responsable de Estadística de la Oficina de Planeamiento e investigación de la Administración provincial de seguro social.

**** INEI-ANLIS Carlos G.Malbràn.
Título “Diversidad de Chlamydia psittaci aisladas de muestras de pacientes y aves con Psitacosis”

Introducción y Objetivo General:
Chlamydia psittaci (C. psittaci) es el agente causal de una zoonosis llamada psitacosis que fue descripta por primera vez en Suiza en la década de 1870. El término psitacosis fue introducido por Morange en París en 1895. Hubo brotes dispersos en Europa y en EEUU, pero la gran pandemia ocurrió en julio de 1929 con aproximadamente 800 casos humanos. La enfermedad comenzó en Argentina y se extendió a Europa y Norteamérica por el tráfico de pájaros exóticos. Los casos fueron bastante agudos y con altas tasas de mortalidad. Las clamidias fueron detectadas en secreciones de pájaros infectados y en humanos en 1930. Este agente (C. psittaci) fue aislado por Bedson y Western en el mismo año por inoculación de material humano en pájaros. Posteriormente se utilizaron ratones para el aislamiento del microorganismo y se diseñó un método de diagnóstico serológico por fijación de complemento. Se comprobó que algunos pájaros sanos eran portadores y constituían fuentes de infección para otras aves y humanos. Además se observó que los psitácidos no eran los únicos reservorios de las clamidias sino que otras especies como palomas patos y pavos podían serlo (1).

Con el advenimiento de las técnicas moleculares, PCR simple, PCR anidada, multiplex PCR anidada, PCR en tiempo real y DNA microarray, el diagnóstico pudo resolverse de manera más específica y rápida. Con el análisis de las secuencias, las Chlamydiales, se agruparon según similitudes de sus genes ribosomales 16S y 23S y se modificó la taxonomía. Luego, por controversias la familia volvió a tener un sólo género, Chlamydia spp. Además se pudieron conocer las serovariedades de Chlamydia psittaci que infectan a los diferentes animales que ofician de reservorio: en aves existen 6 serovariedades (A hasta F), en gatos la WC y en otros mamíferos la M56.(2). La psitacosis es una enfermedad de denuncia obligatoria que requiere un diagnóstico rápido para erradicar la fuente y prevenir nuevos casos.

En nuestro país, la vigilancia nacional de psitacosis, comenzó con el diagnóstico serológico por fijación de complemento en la década del 80 (anticuerpos totales anti- Chlamydia spp. en pares de sueros). En la década de los 90 se la reemplazó por la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para detectar anticuerpos de clase IgG e IgM en pares de sueros. En el 2000 surgió la necesidad de conocer la especie por lo que se optimizó una PCR múltiple anidada (PCRMA) en muestras respiratorias. En este momento se utiliza la IFI en pares de sueros y la PCRMA. Nos faltaría establecer los serovares circulantes de Chlamydia psittaci y relacionarlos con la virulencia, con la fuente infecciosa ( ave,etc) y compararlos con los de otros países.(3)

El objetivo general es el de profundizar el conocimiento eco epidemiológico-molecular de C. psittaci en la República Argentina.
Impacto:

En la repùblica Argentina los estudios realizados brindan resultados no concluyentes ya que en el diagnòstico de humanos es muy dificil conseguir que envien muestras de suero y respiratorias a la vez, limitandosè el diagnòstico a la detecciòn de anticuerpos de clase IgM y/o IgG. Se puede establecer que hay infecciòn reciente pero no la especie de Chlamydia que produce la enfermedad. Ademàs, sòlo podemos sospechar cual es la fuente ya que no existe la capacidad coordinada para realizar esos estudios. El desarrollo de este proyecto aportará la implementación de técnicas que mejorarán el diagnóstico microbiológico,la identificaciòn de la fuente, la correlación de la sintomatologìa clinica con el genotipo contribuyendo al conocimiento de Chlamydia psittaci en nuestra región. Esta información es indispensable para los organismos responsables de la Salud Pública (Ministerios de Salud y Educación, Municipios, etc.) para que puedan obrar en consecuencia y generar sistemas de alerta temprana, tomar medidas de prevención y medidas de control frente a la presencia de un brote epidémico por alguna nueva cepa clamidial


Objetivos específicos:

  • Detectar Chlamydia psittaci en muestras de pacientes que cumplen con la definición de caso de psitacosis (sintomatología clínica compatible y nexo epidemiológico) por serología (IFI), aislamiento (cultivo celular) y biología molecular (PCRMA) .

  • Detectar la fuente infectante (aves, jaulas con heces, nidos de loros, etc.) a través de encuestas y /o pruebas de laboratorio para la detección en aves.

  • Detectar la circulación de Chlamydia psittaci en aves silvestres, incautadas y en cautiverio.

  • Caracterizar los diferentes serovares de Chlamydia psittaci

  • Caracterizar por secuenciación nucleotìdica (MLST) y análisis filogenéticos las cepas de Chlamydia psittaci aisladas y correlacionar estos resultados con los hallados en otras regiones del mundo.


Hipótesis:

  • Hay diferencias en la sensibilidad y en la especificidad en la metodología empleada.

  • Se puede pensar en subregistro si se utiliza una sola técnica para el diagnóstico.




  • Circulan complejos clonales más o menos numerosos y que pueden corresponder a clones internacionales.

  • Los diferentes complejos clonales se relacionan con la virulencia y los síntomas clínicos.



Relevancia del problema:

En Argentina, los primeros casos clínicos de psitacosis fueron descriptos en 1929. En 1939, se produjo un brote epidémico y a partir de entonces se han reportado casos todos los años. En 1977, una epidemia comprendió 180 casos, de los cuales en 71 se confirmó el diagnóstico, registrándose tres muertes. Estudios serológicos realizados en el período 1977-1981 determinaron que el 41% de las muestras presentaban conversión serológica contra C. psittaci. En la mayoría de los casos se observó una asociación con aves psitácidas Las manifestaciones clínicas en humanos se pueden relacionar con neumonías severas, se pueden confundir con sindrome pulmonar por Hantavirus.o con los sìntomas compatibles con dicha enfermedad (fiebre alta, escalofríos, dolor de cabeza, mialgia y dificultad respiratoria). Ademàs,puede presentar síntomas no específicos gastrointestinales como vómitos, dolor abdominal y diarrea. En algunos casos se presentan complicaciones como miocarditis, endocarditis, encefalitis, ictericia y fallas multiorgánicas que pueden producir la muerte del paciente por falta de tratamiento, y en mujeres embarazadas puede manifestarse como una neumonía, hepatitis, insuficiencia renal, sepsis, parto prematuro y muerte fetal. Por otra parte, esta zoonosis, se puede dar en casos aislados o en brotes. Por ello es necesario que la vigilancia cuente con el control coordinado de la enfermedad humana y su fuente animal.
Resultados preliminares y aportes del grupo al estudio del problema en cuestión:
El INEI-ANLIS Carlos G. Malbràn junto con el Ministerio de Salud realiza la vigilancia de Psitacosis en humanos, desde 1980 hasta el 2009 en el Dpto de Virología y en la actualidad en el servicio de Bacteriología Clínica.No existen datos de incidencia de la enfermedad a nivel país por falta de estudios con base poblacional Solamente hemos aportado datos de número de brotes por año, con su análisis correspondiente. Tambien se realiza el diagnóstico en muestras de pacientes con sindrome respiratorio por Hantavirus(diagnóstico diferencial) y en neumonías graves.Para dar una idea de la cantidad de brotes que se estudian por año, tenemos que por ejemplo en el año 2010, se registraron 12 brotes con un total de 216 casos, de los cuales en Jujuy (58), Salta(5), Neuquén (24), Entre Ríos (34), Mendoza (11),Cordoba (2), La Pampa (8), La Rioja (2), Santa Cruz (3), Buenos Aires (27), Conurbano bonaerense y CABA (.21). Por otra parte, dentro de la Vigilancia de C. psittaci, se procesaron 90 casos aislados de psitacosis, con diagnóstico clínico de neumonía por biología molecular y 205 casos por serología (Memorias Bacteriología Clínica INEI 2010).

Con respecto a los datos obtenidos en animales y humanos por el grupo en reciente formación dirigido por la Dra. Cecilia Cuffini se ha encontrado: en la Reserva Provincial de uso múltiple”Bañados del Río Dulce y Laguna Mar Chiquita”, Córdoba en el año 2009-2010 en aves silvestres,no se detectó; en el año 2010-2011, se detectó ADN de este agente presente en el 6% (8/49) de los pacientes ingresados con sospecha epidemiológica de psitacosis. Estas muestras fueron confirmadas por secuenciación y en 4 muestras estudiadas se logró establecer el genotipo presente. El análisis filogenético mostró que 2 secuencias agruparon con cepas aisladas de mamíferos, por lo cual no se pudo establecer un genotipo (WC) y las 2 secuencias restantes agruparon estrechamente con los genotipos A y E/B de. Sería de gran importancia sanitaria detectar este patógeno en estas aves y conocer las posibles fuentes de infección. (Frutos y col,Resumen de Jornadas de AAM-NEA, 2011)
Justificación general de la metodología empleada:

Para el desarrollo de un sistema eficiente de vigilancia epidemiológica médico-veterinaria es indispensable contar con técnicas de diagnósticos confiables para la detección y caracterización de C. psittaci en aves y humanos. Para el diagnóstico, en la introducción se ha descripto la evolución de la metodología que se ha empleado a lo largo del tiempo. Hoy sabemos que las pruebas serológicas tienen muy buena sensibilidad pero poca especificidad, siendo un método de elección para el tamizaje y la detección de casos índices de brotes, ya que el diagnóstico en ellos será tardío. Los métodos moleculares aportan la sensibilidad y especificidad necesarias y la secuenciación daría una idea de si está infectando la misma bacteria al hombre que al animal. El aislamiento es fundamental para pruebas posteriores tales como secuenciación y en un futuro lejano el estudio de resistencia antibiótica.

Tipo de diseño de investigación y métodos:

Se realizará un estudio prospectivo, descriptivo y comparativo entre serovares humanos y animales según región geográfica.
Objetivo específico 1: Detectar C. psittaci en muestras de pacientes que cumplen con la definición de caso probable de Psitacosis por serología (IFI), aislamiento (cultivo celular) y biología molecular (PCRMA)

Definición de caso: “caso probable” paciente con enfermedad respiratoria y nexo epidemiológico (contacto con aves sanas o enfermas) y “no caso” al individuo con nexo epidemiológico pero sin manifestaciones clínicas.

La población humana a estudiar será muestreada desde febrero del 2012 a febrero de 2014.

Detección de anticuerpos anti LPS por IFI:

A las personas que participen del estudio se les extraerá sangre para la detección de anticuerpos antiLPS. Los sueros serán mantenidos a -20°C.

Para la detección de casos humanos de Psitacosis se requerirá las siguientes muestras:

  • Pares de sueros (21 días de diferencia entre ambas, 1° fase aguda y 2° convaleciente) que serán usadas para detección de anticuerpos (necesarios para la identificación del caso índice en un brote). Técnica inmunofluorescencia (IFI) para la detección de anticuerpos de clase IgG utilizada y estandarizada en el Servicio de Bacteriología Clínica.

  • Muestra respiratoria (hisopado nasal y faríngeo HNyF, esputo E, y lavado bronco alveolar BAL (si el paciente requirió ARM). Todas en tubos de transporte para Chlamydia(*)

  • Sangre entera (en tubo nuevo y seco)(*)

*Detección de genoma de C. psittaci por PCRMA en el Servicio de Bacteriología Clínica.

El aislamiento y la secuenciación en muestras de humanos y de aves se realizarán del mismo modo.

El aislamiento requiere de seguridad biológica de tipo III con lo cual se realizará en el BSLIII del ANLIS MALBRÁN.
Objetivo específico 2: Detectar la fuente infectante (animales, jaulas con heces, nidos de loros, etc) mediante las pruebas de laboratorio para la detección de aves.
Objetivo específico 3: Detectar la circulación de C. psittaci en aves silvestres, incautadas y en cautiverio. Caracterizar los diferentes serovares de C. psittaci. (Secuenciación nucleotídica y análisis filogenético de las cepas aisladas)
Objetivo específico 4: Correlacionar estos resultados con los hallados en otras regiones del mundo.
Métodos para procesar muestras de aves

Los muestreos para la captura de aves, se realizarán en 6 regiones de la provincia de Córdoba: Depto. Río Primero; Depto. Unión-Marcos Juárez( Bañados del Saladillo); Depto. Roque Saenz Peña ( Bañados de la Amarga); Depto. Río Cuarto( Río Cuarto y zona aledaña); Depto. Ischillin( Quilino); Depto. Capital: zoológico de Córdoba.

En cada lugar se tendrá en cuenta factores de estrés del animal (asentamientos humanos, actividades realizadas en el lugar, hábitat, entre otros).

Captura de aves silvestres y urbanas: para la captura de aves se emplearán redes de nieblas de diferentes tamaños (4). Las mismas se dispondrán de manera específica en los sitios de muestreos, en horarios matutinos o crepusculares.

Las aves capturadas serán identificadas y se les extraerá muestra de hisopado cloacal (HC) dejándolas en libertad inmediatamente después. Las muestras obtenidas serán refrigeradas y procesadas para su utilización en técnicas de diagnóstico. Por otra parte, se estudiarán muestras de aves relacionadas con casos humanos, recibidas desde las provincias y derivadas al Instituto Vanela de Córdoba.
Aislamiento de las especies de Chlamydias:

Las muestras que resulten positivas en humanos y animales por técnicas moleculares serán sometidas a aislamiento en línea celular LLCMK2 (riñón de mono Rhesus americano) (BSLIII ANLIS- MALBRAN) (5)
Extracción de ADN: se realizará a partir de muestras de hisopados nasofaríngeos de personas e hisopados cloacales de aves utilizando el método de extracción de proteinasa K desarrollado por Sachse y Hotzel 2003(6) en muestras de animales y la extracción estandarizada en Bacteriología Clínica del INEI para las muestras humanas.

Optimización de Nested PCR para la detección de una secuencia del gen que codifica para la proteína mayor de membrana (OMPA) desarrollada según Sachse y Hotzel 2003 (23) para utilizarse en el diagnóstico de muestra de aves.

Purificación de productos de PCR y secuenciación: se utilizará el kit QuiAquick gel extraction kit (QuiAgen, Valencia, CA, USA) según especificaciones del fabricante. Los fragmentos amplificados serán secuenciados en ambas direcciones por el método de Sanger.

Análisis de secuencias: se utilizará el programa Clustal.

El análisis filogenético se realizará empleando el programa MEGA 3, Bootstrap sequencing

y la construcción de árboles de filogenia por Neighbor joining .

Análisis estadístico:

El muestreo será aleatorio no agrupado y el tamaño de la muestra se calculará utilizando el programa de bioestadística EPI Info2000 versión 1.1 mayo 11, 2001 (CDC, USA). Las variables continuas serán analizadas por Test de Student, y las variables categóricas mediante el Test x2.

Cronograma de trabajo AÑO1 y 2




E

F

M

A

M

J

JL

A

S

O

N

D

Estudiar muestras humanas

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Captura Aves




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Tomar muestras Zoológico




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Extracciòn ADN humanas

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Extracción ADN animales


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Aislamiento en cultivos celulares

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Nested PCR muestras animales




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PCRMA muestras humanas

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Anticuerpos IgG en humanos

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Purificaciòn de productos de PCR




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Secuenciaciòn

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Analisis filogenético y estadìstico




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Bibliografìa


  1. Tanner MA, Harris JK, Pace NR. Molecular phylogeny of Chlamydia and relatives. En: Stephens RS. Chlamydia. Intracellular biology, pathogenesis, and immunity, p.1-8.ASM Press, Washington DC, 1999.).

  2. Beeckman DSA, Vanrompay DCG. Zoonotic Chlamydophila psittaci infections from a clinical perspective. Clin Microbiol Infect 2009; 15: 11-17.

  3. Yvonne Pannekoek, Veerle Dickx, Delphine S. A. Beeckman, Keith A. Jolley, Wendy C. Keijzers,Evangelia Vretou, Martin C. J. Maiden, Daisy Vanrompay, Arie van der Ende*. Multilocus sequence typing of Chlamydia reveals an association between Chlamydia psittaci genotype and host species. PLoS One december 2010, Vol 5, issue 12, e14179.

  4. Kumar, S. Tamura, K. Nei, M. MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and -Raso, T.F. Berchieri Jr., A. y Pinto, A. A. Evidence of Chlamydophila psittaci infection in captive Amazon parrot in Brazil. J Zoo Wildl Med. 33: 118–121. 2002.

  5. sequence alignment. Brief Bioinform 5:150-163. 2004.

  6. Sachse, K. Hotzel, H. Detection and differentiation of chlamydiae by Nested-PCR. Methods Mol. Biol. 216:123–136. 2003.


Salvaguardia ética y ambiental
CONSENTIMIENTO INFORMADO
Paciente. …………………………….DNI ………………………; Padre………………..DNI…………….; Madre………………DNI…………………. Tutor……………………..DNI……………………….hemos sido informados por el/la Dr/a ……………………………………, acerca del estudio denominado “Diversidad de Chlamydia psittaci aisladas de muestras de pacientes y aves con psitacosis” que será realizado por profesionales de los centros clínicos provinciales y nacionales y confirmados por profesionales del Laboratorio de Bacteriología clínica del INEI- ANLIS Malbrán, Laboratorio de chlamydias y virus Papiloma humano. Instituto de Virología Dr J.M.Vanella –ANLIS y el Instituto de Virología Dr J.M.Vanella-FCM-UNC. Se nos ha informado que el paciente…………………… requerirá de un estudio microbiológico del material extraído. El procedimiento de extracción de la muestra, podría generar excepcionalmente, alguna complicación no deseada, pero se nos aclaró que el mismo corresponde a la sistemática habitual de este hospital, para el diagnóstico, tratamiento y control de las infecciones como la que se padece. Este estudio podría ayudar a tener mayor conocimiento de las fuentes productoras y de las características de los gérmenes que la producen. No se evaluará tratamientos con diferentes antibióticos, ni ninguna modalidad de tratamiento diferente a la habitual. La participación en este estudio de investigación no ocasionará ningún beneficio directo, pero los resultados que se obtengan servirán para conocer si la cepa circulante es virulenta y qué tipo de ave fue la fuente para tratarla o erradicarla. Se nos ha informado que los datos personales de los pacientes y los que surjan de resultados de éste estudio serán confidenciales. Podrán tener acceso a los datos las autoridades sanitarias y judiciales y el Comité de Ética de la Institución.

Se le ha dado toda la información al paciente en la medida de su posibilidad de comprensión y éste deberá estar de acuerdo con participar de éste estudio. Se nos ha explicado que si decidimos no participar de ello, seremos asistido y tratado igualmente en el hospital. Se nos ha informado que la firma de éste documento no nos hace perder derechos reconocidos por la ley argentina.

Habiendo comprendido todo lo que nos ha explicado e informado, tanto espontáneamente como respuesta a nuestras preguntas, AUTORIZAMOS que los materiales obtenidos puedan ser utilizados por el Servicio de Bacteriología Clínica del INEI “Dr. Carlos G. Malbrán” y los que ellos consideren deben hacerlo con fines de investigación en el proyecto nombrado más arriba, siempre que se preserve la confidencialidad de datos del paciente y los de su familia.

Por último se nos explico que si surgiera algún problema no tratado con la muestra tomada, se nos informará para que prestemos una nueva muestra.

Hospital……………………………………………………………… Localidad………………………………Fecha…/…/…..

Nombre y apellido de la madre…………. DNI……………….. FIRMA………..;

Nombre y apellido del padre……………….DNI…………………FIRMA………………;

Nombre y apellido del paciente…………………………DNI……………….Firma……………

Nombre y apellido profesional informante………………………..Mat……….. Prof………… Firma……………………….

Nombre y apellido del Testigo (de corresponder)……………………………. DNI……………….. Firma………………………


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