La gaussia luciferasa como biomarcador para monitorear progresión de tumor y el tratamiento responde a sistema de metastasis




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fecha de publicación17.01.2016
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LA GAUSSIA LUCIFERASA COMO BIOMARCADOR PARA MONITOREAR PROGRESIÓN DE TUMOR Y EL TRATAMIENTO RESPONDE A SISTEMA DE METASTASIS

INTRODUCCION

En la actualidad son muy pocas las técnicas que están disponibles para la cuantificación de las metástasis sistémica en este trabajo de investigación se uso la Gaussia luciferasa como un biomarcador para observar la progresión de un tumor metastasico y sus respuestas al tratamiento, En tumores de mama se empleara un derivado de la MDA-MB 231celulas que expresan gaussia luciferasa y luego la carga tumoral en sangre y orina junto con la imagen de bioluminiscencia. Para supervisar la respuesta al tratamiento se utilizara Lapatinib inhibidor dual de la quinasa.

OBJETIVOS
Conocer como se realizaron estas investigaciones.

Conocer la importancia de estos experimentos en el tratamiento y evolución de los tumores.

Saber a qué conclusiones llegaron.

MARCO TEORICO

LA GAUSSIA es un copépodo mide de 1mm a 27 mm produce una de las mas brillantes pantallas de biolumuniscencia cuando hacen un giro para escaparse.Son crustáceos relacionados con los cangrejos y langostas, pertenecen al phillum Artrophoda
LUCIFERASAS

Son enzimas que oxidan ciertos agentes luminiscentes para emitir luz (luminiscencia física). Las luciferasas de diferentes organismos han evolucionado de distinto modo, por lo que tienen diferentes estructuras y sustratos.

PRODUCCION DE LA BIOLUMINISCENCIA

La producción de bioluminiscencia es una manifestación energética de algunos animales como dinoflagelados y algunas bacterias, se ha demostrado que la bioluminiscencia se debe a dos sustancias la luciferina y la luciferasa que al reaccionar entre sí en presencia de O2 dan la presencia de luz

La luciferina que ha sido cristalizada contendría un núcleo indolico y según una hipótesis produciría con este una luz azul cuyo espectro seria posteriormente modificado por secuencias contiguas de aminoácidos, las luciferasa poseen las propiedades de una proteína y es de naturaleza enzimática.

La luciferina por acción de la luciferasa se oxida deshidrogenandose y la consiguiente transformación de energía se manifiesta como luz visible, la luciferina muestra un elevado grado de especificidad y solo emite luz al reaccionar con la luciferasa de la misma especie o de especies muy afines desde el punto de vista sistemático



El espectro de la luminiscencia consiste en bandas de diferente amplitud que ocupan posiciones diferentes en la región visible del espectro extendiéndose entre 400 nm y 700nm de ahí derivan los diferentes colores de luz de los diferentes animales luminiscentes, azul,verdoso,amarillo,anaranjado, algunos animales pueden emitir luces de colores diferentes en diferentes partes del cuerpo.

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Mientras que en la mayor parte de los animales es posible extraer las dos sustancias que producen la luz y hacerlas reaccionar con el exterior del organismo en presencia de O2 en las bacterias la reacción luminosa está ligada a la estructura protoplasmática y no es posible reproducirla en vitro



En laboratorio puede cultivarse bacterias sobre medios apropiados, dichas bacterias no son patógenas para el hombre pero pueden serlo para otros animales, existen bacterias que viven en simbiosis en órganos especiales de peces confiriéndoles luminosidad continua.

Mientras que la luz producida por bacterias es continua en presencia de oxigeno y es continua durante la noche y en el día en algunos animales solo reaccionan ante un estimulo y se le llama fosforescencia


Bioluminiscencia no es = "fluorescencia" o “fosforescencia”.

Fluorescencia: la energía de una fuente de luz es absorbida y reemitida como otro fotón.

Bioluminiscencia: la energía para la excitación proviene de una reacción química y no de una fuente de luz

ALGUNOS ANIMALES EMITEN BIOLUMINICENCIA



La bioluminiscencia es un fenómeno relativamente frecuente en bastantes especies marinas; las últimas estimaciones consideran que hasta un 90% de los seres vivos que habitan en la porción media y abisal de los mares podrían ser capaces de producir luz de un modo u otro. En hábitats terrestres la bioluminiscencia no es tan común. La luz emitida por el pescado o la carne en descomposición se debe a bacterias mientras que la de la madera muerta se debe tanto a bacterias como a los micelios de ciertos hongos

En algunas especies sirve como referencias sexuales y ayudas en el emparejamiento (el caso de las luciérnagas); en otras funcionan a modo de cebo (como en el caso de algunos pejesapos) y en otras como defensas para confundir a los depredadores

ALGUNOS ANIMALES QUE EMITEN FOSFORESENCIA



TIPOS DE LUCIFERASA La fosforescencia la producen algunos algunos poliperos por los poros que encierram algunas medusas, algunos anélidos moluscos y crustáceos a algunos, así como el brillo de los ojos de algunos mamíferos que sus ojos brillan en la noche particularmente de las vacas los gatos que reflejan la luz

La reacción catalizada por la luciferase de firefly lleva a cabo en dos pasos:

  • Luciferina + ATP → luciferyl adenilato + PP i

  • Adenilato luciferyl + O 2 → oxyluciferin + AMP + luz

La reacción es muy energéticamente eficiente: casi la totalidad de la entrada de energía en la reacción se transforma en luz

Se ha descubierto una sutil diferencia estructural en luciferase que causa el cambio de color de emisión de bioluminiscencia de un color amarillo verdoso a rojo. La estructura de luciferase de tipo salvaje y mutante rojo (S286N) luciferase de la japonesa Genji-Botaru (Luciola cruciata) en complejo con un análogo intermedio 5 ' - O-[N-(dehydroluciferyl)-sulfamoyl] adenosina (DLSA) fue examinado y estudios mostraron que la luciferase de tipo salvaje acomplejado con DLSA exhibió una «formulario cerrado' del sitio activo, donde la cadena lateral de aminoácido isoleucina 288 se desplazó hacia el anillo de benzothiazole de DLSA, creando un bolsillo hidrofóbico rígido. El luciferase de tipo salvaje 'forma cerrada' había enlazado el estado excitado de oxyluciferin en un microentorno muy rígido y no polar, minimizando la pérdida de energía antes de emitir luz de color amarillo verdoso. La luciferase de S286N acomplejado con DLSA exhibió un ' Abrir formulario ' del sitio activo, donde la cadena lateral de aminoácido de isoleucina 288 no se mueve hacia el anillo de benzothiazole de DLSA, creando un menos rígida y menos microentorno hidrofóbico. La luciferase de S286N 'formulario abierto' tenía un microentorno menos rígido que permite cierta pérdida de energía desde el estado excitado de oxyluciferina, que dio lugar a la emisión de luz roja de baja energía.

Ejemplos

Una variedad de organismos regulan su producción de luz usando diferentes luciferases en una variedad de reacciones de salida de la luz. Los más famosos son las luciernagas aunque la enzima existe en organismos tan diferentes como el hongo de Jack-O-linterna (Omphalotus olearius) y muchas criaturas marinas. En las luciérnagas, el oxígeno necesario se suministra a través de un tubo en el abdomen que se llama traquea abdominal. Las luciferases de las luciérnagas - de los cuales hay más de 2000 especies - y de la Elateroidea (luciérnagas, escarabajos y familiares) en general - son lo suficientemente diversos como para ser útil en filogenia molecular. El luciferase más minuciosamente estudiado es el de las luciérnagas de Photinini pyralis de Photinus, que tiene un pH óptimo de 7,8.

También se ha estudiado luciferasa de Renilla reniformis. En este organismo, la luciferasa está estrechamente asociada con una proteína de enlace de Luciferina, así como una proteína verde fluorescente (GFP). Liberación de desencadenadores de calcio de la Luciferina (coelenterazine) de la proteína de enlace de Luciferina. El sustrato está disponible para oxidación por el luciferase, donde se está degradado a coelenteramide con una resultante de la liberación de energía. En la ausencia de GFP, esta energía sería lanzada como un fotón de luz azul (nm de longitud de onda 482 de emisión pico). Sin embargo, debido a la GFP estrechamente asociada, la energía liberada por el luciferase en su lugar se acopla a través de la transferencia de energía de resonancia con el fluorocromo de la GFP y posteriormente es liberada como un fotón de luz verde (emisión máxima longitud de onda 510 nm). La reacción catalizada es:

Recientemente se han identificado luciferases más recientes que, a diferencia de luciferase de Renilla o Firefly, son moléculas secretadas naturalmente. Un ejemplo es la luciferase de Metridia (MetLuc) que se deriva de los Copépodos marinos Metridia Longa. El gen de luciferase secretada de longa Metridia codifica una proteína de 24 kDa, que contiene un péptido señal secretoras de N-terminal de residuos del aminoácido 17. La sensibilidad y la alta intensidad de la señal de esta molécula de luciferase resulta ventajoso en muchos estudios de reportero. Algunos de los beneficios de la utilización de una molécula de reportero secretada como MetLuc es su no-vivir de lisis protocolo que permite a uno poder llevar a cabo en la celula ensayos y varios ensayos sobre la misma célula



Luciferase pyralidae firefly luciferase

APLICACIONES

Luciferase puede ser producida en el laboratorio mediante ingeniería genética para varios propósitos. Los genes de Luciferase pueden ser sintetizados y insertados en los organismos o transferidos en las células. Ratones, gusanos de seda y las patatas son pocos los organismos que ya han sido diseñados para producir la proteína. ]

En la reacción de luciferase, la luz es emitida cuando luciferase actúa con el sustrato apropiado Luciferina. Emisión de fotones puede ser detectada por luz en aparatos sensibles tales como un luminometer o modificando microscopios ópticos. Esto permite la observación de los procesos biológicos.

En la investigación biológica, luciferase comúnmente se utiliza como reportero para evaluar la transcripción actividad en las celdas que se transfieren con una construcción genética que contiene el gen de luciferase bajo el control de un promotor de interés.Luciferase también puede utilizarse para detectar el nivel de celulares ATP en estudios de viabilidad de células o para ensayos de actividad de quinasa Además, moléculas de proluminescent que se convierten en Luciferina a la actividad de una enzima particular pueden utilizarse para detectar la actividad enzimática en junto o ensayos de luciferase de dos pasos.

Estos sustratos se han utilizado para detectar la actividad de la caspasa y citocromo P450, entre otros.

Toda imagen de animales en vivo o, en ocasiones, ex vivo son una técnica poderosa para el estudio de poblaciones de células de animales vivos, tales como ratones. Diferentes tipos de células (por ejemplo, la médula ósea células, las células T) pueden diseñarse para expresar un luciferase que permite su visualización no invasiva dentro de un animal vivo, usando una técnica de este sensible de cargo-par de dispositivo cámara (cámara CCD) ha sido utilizado para seguir se y la respuesta de los tumores al tratamiento en modelos animales. Sin embargo, factores ambientales y a la interferencia terapéutica puede causar algunas discrepancias entre la intensidad de carga y bioluminiscencia de tumor en relación con cambios en la actividad proliferaría. La intensidad de la señal que se mide por la creación de imágenes en vivo puede depender de varios factores, como la absorción de D-Luciferina a través del peritoneo, el flujo de sangre, la permeabilidad de la membrana de la célula, disponibilidad de co-factors, el pH intracelular y la transparencia de las superpuestas de tejido, además de la cantidad de luciferase.

Luciferase puede utilizarse en los bancos de sangre para determinar si los glóbulos rojos están comenzando a destruirse. Los investigadores forense pueden utilizar una solución diluida que contienen la enzima para descubrir rastros de sangre restante sobre superficies en una escena del crimen. Luciferase es una proteína sensible de calor que se utiliza en estudios sobre la desnaturalización de la proteína, pruebas de la capacidad protectora de proteínas de choque térmico. Las oportunidades para el uso de luciferase continuarán expandiendose

GAUSSIA LUCIFERASA SECRETADA COMO UN BIOMARCADOR PARA SEGUIMIENTO DE PROGRESION TUMORAL Y LA RESPUESTA AL TRATAMIENTO DE METASTASIS SITEMICA

  • Existen pocas técnicas para:

    • Cuantificación de metástasis sistémica

    • Detectar la colonización metastasica

  • Y evaluarlos en tiempo real

  • Se investigo:

    • Gaussialuciferasse como un biomarcador circulante

    • Se monitorio el crecimiento metastasico del tumor y sus respuestas al tratamiento

1º Desarrollo tumores de pecho primarios y metastasicos con un derivado de células que expresan Gaussia luciferasse

2º se observo el volumen del tumor primario la [ ] Gaussia luciferase en sangre y en orina después de la implantación observándose un crecimiento del volumen del tumos días posteriores

3º En el modelo experimental se encontró metástasis cerebral así como en hueso y pulmones, se localizo metástasis por BLI.

4º Se utilizo sangre del ensayo de Gaussia luciferase para supervisar la respuesta con tratamiento con LAPATINIB

SE DEMOSTRÓ

  • 1ª El ensayo de Gaussia luciferase secretada refleja la cantidad de celular cancerígenas en tumores primarios como metastasicos.

  • 2º Gaussia luciferase sirve como biomarcador, en el ensayo de Gaussia luciferase en sangre permite la supervisión de la respuesta del tratamiento en un modelo metastasico.

MARCADORES TUMORALES

Son cualquier sustancia que puede relacionarse con la la presencia o progresión del tumor, en la practica en los laboratorios de bioquímica miden la concentración de marcadores que están presente en el plasma, se le puede aplicar también a sustancias que se encuentran en la superficie o en el interior de células fijadas en cortes congelados o con parafina, un marcador tumoral plasmático ha sido secretado o liberado por las células tumorales, estos marcadorees no son productos únicos de las células malignas si no que pueden ser expresados por el tumor en mayor cantidad que las células normales. Pueden ser hormonas o enzimas

Se usan para el diagnostico,pronostico y detección de una enfermedad

Son sustancias que pueden encontrarse en:

El cuerpo sangre y orina cuando hay presencia de cáncer

Productos de células cancerosas o en respuesta al cáncer

No específicos

  • Los marcadores tumorales se usan para detectar, diagnosticar y manejar ciertos tipos de cáncer. Aunque una concentración anormal de un marcador tumoral pueda sugerir la presencia de cáncer, esto, por sí mismo, no es suficiente para diagnosticar el cáncer.

  • Para algunos tipos de cáncer, las concentraciones de los marcadores tumorales reflejan el estadio (etapa o extensión) de la enfermedad.

El marcador normalmente es identificado al combinar la sangre u orina con anticuerpos sintéticos que reaccionan con la proteína del marcador tumoral.

USO DE LOS MARCADORES TUMORALES

ALGUNOS DE LOS MARCADORES TUMORALES

El primer marcador tumoral moderno usado para detectar el cáncer fue la gonadotropina coriónica humana (HCG), la sustancia que los médicos observan en las pruebas de embarazo. Un nivel alto de HCG en la sangre puede que indique la presencia de un cáncer de la placenta llamado neoplasia trofoblástica del embarazo (GTD, por sus siglas en inglés).

  • Antígeno carcinoso CA 15.3:(Se asocia a cáncer de mama)

  • Antígeno carcinoso CA 125:(se asocia al cáncer ovárico)

  • Antígeno específico de la próstata (PSA):(producido por células epiteliales de la próstata)

  • La alfafetoproteína (AFP)( normalmente solo se produce en el feto cuando aparece en adulto es marcador tumoral

CARACTERISTICAS DE LA BIOLUMINISCENCIA

  • Es una técnica usada en la ingeniería de tejidos, básicamente es aplicable en ensayos en vivo.

  • La bioluminiscencia es parte de técnicas ópticas de imagen, al igual que la fluorescencia.

Muchos organismos emiten luz entre 440 y 479nm

Usos

  • Detectar la cantidad de ATP presente en una superficie.

  • Determinación de higiene por ATP-Bioluminiscencia utilizada en cualquier tipo de industria de Alimentos (Lácteos, Bebidas, Productos Cárnicos, Comidas Preparadas, etc).

  • Determinar presencia de virus en una célula.

  • Diversos campos como: microbiología, ingeniería genética, etc.

  • Ver como se diseminan las células cancerosas.

Identificar tumores. Por ejm tumor hepático

Ventajas

  • Rapidez en la obtención de los resultados: lectura de resultados en segundos.

  • Instrumental de fácil manejo: equipos portátiles.

  • Técnica sencilla: hisopado de superficies.

  • Elevada Sensibilidad: Detección de muy bajos niveles de ATP.

  • Prevención de fallas mayores: permite llevar a cabo acciones correctivas.

Desventajas

  • Costo elevado de los equipos.

  • Resultados se presentan en una escala arbitraria que es difícil de aceptar por los microbiólogos acostumbrados a obtener resultados exactos como unidades formadoras de colonias (UFC).

  • No indica presencia de patógenos sólo la presencia de ATP.

Los compuestos químicos tales como detergentes y desinfectantes pueden interferir en la reacción

EXPERIMENTO

  • Animales: Ratones

  • Anestésicos: Ketamina/Xilazina

  • Líneas Celulares y cultivo celular.

  • Suero fetal bovino al 10%

  • Penicillinstreptomycin al 1%

  • Solución de EDTA al 20%

Para este procedimiento:

a)Se utilizó el modelo de mama ortotopico.

El cual consiste en la implantación de células cancerigenas en el tejido graso de los ratones( Región mamaria ).

b)El modelo experimental de metástasis sistémica

Se aplicó una inyección intracardiaca

a ratones de 6-7 semanas de edad.

PROCEDIMIENTO DE GAUSSIA LUCIFERASA

En el caso de las muestras de sangre y orina.

Se extrajo sangre directamente de las venas de las colas de los ratones . Y la orina fue recolectada directamente de la uretra

Tratamiento

Se utilizó el medicamento Lapatinib.(evita que proliferen las células cancerosas)

Administración por sonda oral.

Técnica de bioluminiscencia



Cuantificación de tumor viable

Se utilizó la tinción de H&E.

La sección manchada de los tumores fue analizada donde se aprecio secciones histológicas necróticas del tumor viable

Tratamiento

Se utilizó el medicamento Lapatinib.

Administración por sonda oral.

Técnica de bioluminiscencia

El LAPATINIK

  • El lapatinib es un inhibidor de la kinasa 4-anilinoquinazolina, con un mecanismo único de acción, ya que es un potente inhibidor selectivo y reversible de los dominios intracelulares de tirosina kinasa, tanto de los receptores EGFR (ErbB1) como del gen HER2+/neu (ErbB2).

  • La estimulación de los receptores EGFR (ErbB1) y HER2 (ErbB2) está asociada a la proliferación celular y a múltiples procesos involucrados en la progresión del tumor, invasión y metástasis. El lapatinib Actúa sobre la componente intracelular de los receptores antes citados.


CONCLUSIONES

1.-Se concluye que el experimento se basa en la modificación de los genes para que se produzca la luciferasa que funciona como un indicador de las células cancerosas y la cual se mide en orina al medir uno de los productos que se libera de la reacción de la luciferasa con la luciferina

2.-Tambien se toma en cuenta el lapatinib que es un medicamento que ayuda a combatir el cáncer y al reducirse las células cancerosas también se reducen las células que producirían luciferina y por consecuencia a nivel de orina ,el producto liberada de la reacción de la luciferina con la luciferasa se reduciría ,lo cual seria un indicador de que se combate al cáncer y de que el medicamento surte efecto

3.-Con este estudio de investigación se demostró que la Gaussia luciferasa refleja con exactitud la cantidad de células cancerosas viables en los tumores primarios y metastasicos.

4.-Se puede emplear para seguir la progresión de un tumor metastasico.

5.-Y como biomarcador para la respuesta tumoral a los tratamientos

Gaussia luciferasa









FUENTES

http://books.google.com.pe/books?id=SunKnx91u4kC&pg=PA895&dq=luciferasa+y+el+cancer&hl=es&ei=RaSDTI-5N4L58Aa34939AQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=2&ved=0CC4Q6AEwAQ#v=onepage&q&f=false
http://books.google.com.pe/books?id=eAYkbUxxzEkC&pg=PA258&dq=luciferasaen+tratamientos+de+cancer&hl=es&ei=KJqBTO-yMYH88Aa7iZnWAQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=1&ved=0CCkQ6AEwAA#v=onepage&q&f=false
http://books.google.com.pe/books?id=nVRGQC2pDTkC&pg=PA148&dq=luciferasa&hl=es&ei=N5WBTPToEoG78gaS3dmdBQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=5&ved=0CDcQ6AEwBA#v=onepage&q=luciferasa&f=false
www.wikipedia.com

www.plosone.org
http://books.google.com.pe/books?id=MVetIy6zhvYC&pg=PA130&dq=marcadores+tumorales&hl=es&ei=uA6JTIjCMYza9AS7zNngDg&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=4&ved=0CDUQ6AEwAw#v=onepage&q=marcadores%20tumorales&f=false

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