1. Orientación diagnóstica rápida Indica características inflamatorias Orienta en infecciones mixtas (anaerobios) Algunas Aplicaciones Clínicas




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título1. Orientación diagnóstica rápida Indica características inflamatorias Orienta en infecciones mixtas (anaerobios) Algunas Aplicaciones Clínicas
fecha de publicación25.09.2016
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Generalidades y fundamento de la Coloración de Gram. Aplicaciones clínicas.
La tinción de Gram se utiliza como un método de despistaje para evaluar la calidad de diferentes tipos de muestras clínicas, incluyendo muestras respiratorias, orina y muestras no invasivas de heridas. La base científica de esta tinción consiste en que la presencia de polimorfonucleares se considera indicativa de la existencia de inflamación o infección, y la de células epiteliales se considera indicativa de contaminación superficial de la muestra. Esta tinción también se puede utilizar para decidir cuántos microorganismos se van a valorar en muestras con cultivos polimicrobianos. Además, la observación de determinados microorganismos puede indicar la realización de procedimientos especiales de trabajo (inoculación de la muestra en medios especiales, incubar los medios en determinadas condiciones o prolongar la incubación).

Es de bajo costo y gran utilidad:

1. Orientación diagnóstica rápida

2. Indica características inflamatorias

3. Orienta en infecciones mixtas (anaerobios)
Algunas Aplicaciones Clínicas:

1. Orina:
El examen microscópico con tinción de Gram es el método más simple, más rápido, más barato y probablemente más fiable para identificar muestras de orina con recuentos bacterianos iguales o superiores a 105 UFC/ml. Sin embargo, no es posible detectar bacteriurias inferiores por examen microscópico. Además de su baja sensibilidad, el examen individual de cada muestra por esta técnica lleva demasiado tiempo y resulta impracticable como método de rutina, aunque debe disponerse de ella en los casos seleccionados que requieran un examen rápido de orina.

La tinción de Gram también puede ser útil para establecer el tratamiento empírico de sepsis urinarias de naturaleza polimicrobiana, como las asociadas a una infección nosocomial o en portadores de sonda urinaria. Así, la visualización de cocos grampositivos obligará a cubrir fundamentalmente enterococo; por otro lado, si sólo se observan bacilos gramnegativos, el tratamiento antibiótico puede realizarse con antibióticos con actividad frente a los mismos, cubriendo también Pseudomonas aeruginosa, tales como aztreonam o ceftazidima y/o amikacina.

2. Esputo:

La aplicación de la tinción de Gram al esputo constituye unos criterios estandarizados de cribado y permite determinar el grado de contaminación y la calidad de la muestra antes de la realización del cultivo y establecer, de este modo, unos criterios de rechazo. No obstante, la tinción de Gram presenta también problemas, por su gran variabilidad en la especificidad, sensibilidad y reproducibilidad, dependiendo de factores como la muestra y la experiencia del observador.

La evaluación adecuada de la tinción de Gram de la muestra es crítica para asegurar que sólo se procesan muestras de calidad. Los criterios de aceptabilidad del esputo y de las secreciones traqueales se basan en la presencia de numerosas células inflamatorias y la ausencia o escasez de células epiteliales, que se consideran indicadoras de contaminación orofaríngea superficial.

Para la aceptación de la muestra, varios autores han descrito criterios celulares cuantitativos de cribado que difieren en el número límite de leucocitos y células epiteliales aceptables, pero todos coinciden en considerar que un número elevado de células epiteliales indica contaminación orofaríngea. En general, los criterios de Murray y Washington (1975) establecen como esputo de calidad aceptable para el cultivo la muestra que contiene: > 25 leucocitos/campo de 100X y < 10 células epiteliales escamosas/campo de 100X

En el caso de la presencia concomitante de numerosos leucocitos y células epiteliales escamosas, Heineman y Radano (1979) establecen como criterio de aceptación el índice de > 10 leucocitos/1 célula epitelial.

Por otra parte, la detección en un esputo, aceptable por los criterios citológicos anteriores, de un morfotipo bacteriano claramente predominante sobre el resto de la microbiota que habitualmente contamina estas muestras, permite sugerir, con sensibilidad variable (57% para S. pneumoniae; 82% para H. influenzae), el agente etiológico de la neumonía y ayuda en la valoración de los microorganismos crecidos en los cultivos. Así, algunos morfotipos de microorganismos, como Haemophilus, Bacteroides y los bacilos entéricos pueden ser fácilmente identificados en la tinción de Gram. Por otra parte, en algunos microorganismos como, S. aureus y M. catarrhalis, se ha establecido una correlación del 69-93% y del 90%, respectivamente, entre la presencia en gran cantidad (>50 microorganismos/campo de 1.000X) de sus correspondientes morfotipos en la tinción de Gram y la evidencia clínica de neumonía causada por estos agentes. Igualmente, un aumento significativo de la microbiota mixta (>50 microorganismos/campo de 1.000X) y la detección de microorganismos intracelulares grampositivos y gramnegativos, es claramente sugerente (valor predictivo del 79%) de neumonía por aspiración.

Los laboratorios que reciben esputos y secreciones traqueales para tinción y cultivo, deben seguir las siguientes recomendaciones:

-Examinar con bajo aumento (100X) de 20 a 40 campos de la extensión del esputo o secreción endotraqueal teñidos con tinción de Gram. Realizar una media del número de células en los campos representativos que contengan células. Se aceptarán para cultivo:

- Las muestras con > 25 leucocitos/campo de 100X y < 10 células epiteliales escamosas/campo de 100X.

- Las muestras con > 25 leucocitos/campo de 100X y >10 células epiteliales/campo de 100X, cuando el cociente leucocito/célula epitelial sea >10 y exista un predominio franco (3 ó 4 +) de un único morfotipo bacteriano.

Cuando en una muestra con numerosos leucocitos (4+) y detritos celulares no se observan microorganismos, puede ser útil inundar la extensión con naranja de acridina y observarla con microscopio de fluorescencia para confirmar la ausencia de microorganismos en los detritos. Pseudomonas y Haemophilus pueden no observarse en estas tinciones por la dificultad de diferenciación entre los detritos celulares. Legionella se puede observar con la tinción de naranja de acridina, aunque en esta infección hay a menudo ausencia de leucocitos en el esputo.

Se rechazarán e informarán como "muestra inaceptable" o "no compatible con procesos infecciosos bacterianos", según corresponda, las siguientes muestras:

- Esputos con >10 células epiteliales/ campo de 100X.

- Aspirados traqueales de adultos con >10 células epiteliales/campo de 100X, o los aspirados en los que no se observan microorganismos.

- Aspirados traqueales de pacientes pediátricos en los que no se observen microorganismos, independientemente del número de células epiteliales.

No se rechazarán los esputos y aspirados endotraqueales con petición de cultivo para Legionella, Mycobacterium, Nocardia y Rhodococcus, ni las muestras de pacientes con fibrosis quística o neutropenia aunque no cumplan los criterios citológicos de calidad.
3. Líquidos Estériles

La observación de cualquier morfología bacteriana, aunque sea única es indicativa de infección. Por ejemplo, la tinción de Gram del líquido cefalorraquídeo permite identificación del agente etiológico en aproximadamente 60 a 90% de los casos de meningitis bacteriana, en el caso de meningococo evidencia reacción leucocitaria y diplococos Gram negativos intra o extracelulares.

4. Gonorrea en el hombre.

La observación de diplococos Gram negativos intracelulares a partir de una secreción uretral purulenta es indicativo de gonorrea.

5. Infecciones por Anaerobios

La tinción de Gram es de una gran utilidad en el diagnóstico microbiológico presuntivo de infecciones producidas por anaerobios, ya que proporciona información acerca de los tipos de bacterias existentes, cantidad relativa de las mismas, presencia de leucocitos, etc. Por otra parte, es un elemento importante para el control de calidad del laboratorio. Si no se consigue aislar todos los morfotipos observados, puede ser debido, probablemente, a algún fallo en los distintos pasos del diagnóstico de los anaerobios (recolección de la muestra, transporte o procesamiento), o bien se trata, aunque es menos común, de una inhibición del microorganismo por un antibiótico residual. Además, la presencia de tipos morfológicos múltiples en la tinción de Gram sugiere específicamente el diagnóstico de infecciones por anaerobios, puesto que la mayoría de las infecciones en las que están implicados son polimicrobianas

Coloración de Gram: teoría y fundamento

En 1884, el físico danés Hans Christian Gram desarrolló una tincÍón compuesta, que es probablemente la más importante que se usa en bacteriología. Sobre la base de esta coloración, las bacterias se pueden clasificar en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas.

Durante este procedimiento, una vez fijada la muestra al portaobjeto, se añade una solución de violeta de genciana o cristal violeta (colorante primario) que penetra todas las bacterias de la preparación. Luego se agrega solución de lugol (mordiente), el yodo entra en la célula y forma un complejo insoluble con la violeta de genciana, posteriormente se procede a la decoloración con una mezcla de alcohol-acetona; las bacterias cuya pared celular es más densa, constituidas principalmente por peptidoglicano (Grampositivas), se deshidratan y cierran los poros de la pared impidiendo la salida del complejo violeta de genciana-yodo, por lo tanto estas bacterias permanecen de color púrpura; mientras que las bacterias gramnegativas, debido a su alto contenido de lípidos, al decolorar estos lípidos se deshidratan o desnaturalizan y desaparecen del espacio que los contiene, quedando poros en la pared donde antes estuvieron los lípidos. Esto permite la salida del complejo violeta de genciana-yodo en las bacterias gramnegativas, pero no en las grampositivas y al adicionar el colorante de contraste (safranina), las primeras toman dicho colorante por lo que se observan de color rosado. En la tabla 1 se resume el aspecto de ambos tipos de células después de cada paso del procedimiento de tinción de Gram.

Tabla 1. Aspecto de las bacterias durante los diferentes pasos de la coloración de Gram

Después del colorante o reactivo

Grampositivas

Gramnegativas

Cristal violeta

Púrpura

Púrpura

Lugol

Púrpura

Púrpura

Alcohol acetona

Púrpura

Incolora

Safranina

Púrpura

Rosada

Técnica de coloración de Gram

Luego de extender la muestra sobre la lámina de vidrio portaobjeto, la cual previamente

debe estar limpia y seca, se procede de la siguiente manera:

1. Fijar el extendido por calor pasando el portaobjeto a través de la llama del mechero

con un movimiento rápido (3 veces).

2. Aplicar el colorante violeta de genciana por un minuto.

3. Lavar con agua corriente.

4. Aplicar el lugol por un minuto.

5. Lavar con agua corriente.

6. Aplicar el alcohol-acetona durante 10 segundos.

7. Lavar con agua corriente.

8. Aplicar la safranina por 30 segundos.

9. Lavar con agua, secar al aire y observar en el microscopio.

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