Biocompatibilidad: conceptos básicos




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Biosíntesis enzimática

Algunas pruebas in Vitro utilizan la actividad biosíntesis enzimática de las células para evaluar la respuesta citotóxica. Pruebas que miden la síntesis de DNA o la síntesis proteica son un ejemplo de este tipo de pruebas, estas se llevan acabo agregando precursores de radioisótopos marcados (3H-timidina o 3H-leucina) al cultivo celular y luego los que son incorporados al DNA o proteína, son cuantificados. De esta forma se determina la influencia del material sobre la síntesis de proteínas en un cultivo celular (5).

El ensayo con MTT es otra prueba encimática comúnmente utilizada para medir la citotoxicidad de los materiales, tiene como propósito medir la actividad de la deshidrogenasa celular. Es una prueba simple debido a que no requiere de radioisótopos, es rápida y precisa ya que permite cuantificar exactamente el número de células viables (9).

La deshidrogenasa celular tiene la capacidad de convertir la molécula denominada MTT, por medio de distintos agentes reductores, en un compuesto de formazan, azul insoluble. Si la deshidrogenasa se encuentra inactiva por efectos citotóxicos de un material, no se formará el formazan. La producción de formazan puede ser cuantificada disolviendo el líquido y midiendo la densidad óptica de la solución restante. La cantidad de Formazan producida es directamente proporcional al número de células viables (Imagen #4) (5).

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Figura 4





Imagen 4 tomada de CRAIG, R. Materiales de Odontología restauradora. Ed. Harcourt Brace. 11 edición p 137, para ilustrar como la deshidrogenasa celular convierte la molécula MTT (la cual es amarilla y soluble), por medio de distintos agentes reductores, en un compuesto de formazan, azul insoluble.


Pruebas indirectas (uso de barreras)


En la mayoría de las pruebas de citotoxicidad, el material entra en contacto directo con los cultivos celulares. Investigadores reconocen que In vivo, existe poco contacto directo entre las células y el material, esto debido a la presencia de un epitelio queratinizado, dentina o matriz extracelular, debido muchos estudios sin el uso de barreras, no son extrapolables a lo que sucede en la clínica. Por ejemplo, el Oxido de zinc y Eugenol, es un material que genera una respuesta relativamente leve sobre el tejido pular, en comparación con las respuestas severas que se obtienen cuando el mismo material entra en contacto directo con células In Vitro, o en ensayos de implantación. Debido a lo anterior, se han ideado pruebas In Vitro utilizando barreras para simular mejor las condiciones In Vivo.

Un ejemplo de ensayos indirectos es Método de cubierta de Agar. El Agar forma una barrera entre las células y el material dental, el cual es colocado encima del agar. Nutrientes, gases y sustancias tóxicas solubles pueden difundirse a traves del agar, si el material es citotóxico, las células serán lesionadas y el rojo neutro será liberado, dejando así una zona de inhibición de crecimiento celular (Imagen 5) (10).

Imagen # ilustrando el Método de cubierta de Agar.

MÉTODO DE CUBIERTA DE AGAR

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Figura 6




Si el material es citotóxico → lesiona las células → rojo neutro se libera → zona de inhibición

Estrato de células teñidas con rojo neutro

Pruebas de barrera dentinal


Muchos estudios han demostrado que la dentina forma una barrera por la cual atraviesan sustancias tóxicas que logran lesionar el tejido pulpar, por este motivo se han ideado ensayos que utilizan discos de dentina como barrera entre el material y el cultivo celular. Este método ofrece la ventaja de difusión direccional entre el material restaurador y el medio de cultivo celular (Imagen # 6).

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Figura 6




Imagen 6 tomada de http://www.ccs.ufpb.br/ morfologia/atlasdente.htmn Para ilustrar como la dentina forma una barrera por la cual atraviesan sustancias tóxicas que logran lesionar el tejido pulpar.


Para llevar acabo esta prueba (Imagen 7), se coloca el material a evaluar (A) sobre el disco de dentina (B). Al otro lado del disco se encuentra en contacto con el cultivo celular o cámara de recolección (C). Componentes del material se logran difundir atreves de la dentina y el efecto sobre el medio de cultivo puede ser evaluado. Para determinar la rata de difusión, se puede recolectar el fluido circulando dentro y fuera de la cámara de recolección. 

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Figura 7




A. El material

B. Disco de dentina  en el aparato utilizado para sujetarlo

C. Lado del disco en contacto con cultivo celular (cámara de recolección).

D. Cultivo celular Citotoxicidad del material

 



Imagen 7 cortesía del Dr. Carlos Andrés Ochoa para ilustrar un modelo utilizando discos de dentina como barreras para tratar de predecir la toxicidad de los materiales In vivo.


Pruebas de
 Mutagénesis y carcinogénesis

Estas pruebas estudian el efecto de los materiales sobre el material genético tanto en células como en bacterias y posteriormente se evalúan los materiales en mamíferos. Se realizan en un orden específico y se detienen cuando existe cualquier indicio de mutagenicidad por parte del material o químico.

Existen muchos mecanismos por los cuales una sustancia puede afectar el material genético de la célula. Los mutágenos genotóxicos alteran directamente el DNA de la célula a través de diferentes tipos de mutaciones, pero estos no son considerados cancerígenos. Pueden ser mutagénicos en su estado nativo, o en algunos casos requieren de activación o biotransformación, por lo que se denominan promutágenos.

Los mutágenos epigenéticos no alteran el DNA directamente, pero si favorecen el crecimiento tumoral alterando la bioquímica celular, su sistema inmune, actuando como hormonas o por medio de otros mecanismos. Debido a lo anterior, estos materiales sí se consideran cancerígenos.

Carcinogénesis se denomina como la capacidad del material dental para producir neoplasia In Vivo. Los mutágenos pueden o no ser carcinogénicos, de igual manera los materiales carcinogénicos pueden o no ser mutágenos, por esto la cuantificación y relevancia de las pruebas que intentan medir mutagénesis y carcingénesis de los materiales son extremadamente complejas (Imagen#8).




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Imagen 8
tomada de http://www.sandia.gov/news-center/news-releases/2005/images/
mitopic.jpg


Para ilustrar los cambios estructurales que se pueden observar entre una célula en estado normal y una célula cancerígena.

Célula normal

Célula cancerigena

Figura 8








El ensayo de mutagénesis a corto plazo más comúnmente utilizado y con excelente valides  es la prueba de AMES. Se utilizan Cepas mutantes de Salmonella typhurium (Imagen #9), las cuales requieren de histidina exógena, las cepas nativas no necesitan histidina exógena, por esto la exclusión de la histidina exógena del medio de cultivo permite evaluar si un material tiene la habilidad de convertir células mutantes en células nativas. Químicos con una elevada frecuencia de conversión celular tienen una alta probabilidad de ser carcinogénicos en mamíferos, ya que altera el material genético celular (Imagen #10).


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Imagen 9
tomada de www.zdravljeizivot.com/hrv/ index.php?k=saznaj...  mostrando Salmonella typhimurium

Figura 9









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Figura 10




Imagen 10 ilustra como se puede evaluar si un material tiene la habilidad de convertir células mutantes en células nativas, por medio de la exclusión de la histidina exógena.

Otra prueba para evaluar la mutagénesis es la prueba de transformación celular de STYLES. Fue creada con el objetivo de ofrecer una alternativa a los ensayos en bacterias como la de AMES, ya que utiliza cultivos celulares de mamíferos, principalmente fibroblastos.

Cuantifica la capacidad de cancerígenos potenciales para transformar líneas celulares estandarizadas, esto se lleva acabo de la siguiente forma: normalmente fibroblastos nativos no crecen en un cultivo de agar blando, en cambio células geneticamente transformadas sí crecen en este medio, basandose en esto, fibroblastos nativos son colocados en contacto con el material que se esta evaluando, luego de un tiempo determinado los fibroblastos son colocados en un gel de agar, si el crecimiento celular es positivo, significa que las células fueron transformadas a una cepa mutante y por ende el material evaluado es un potencial cancerígeno (Imagen 11) (11).

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Figura 11






Imagen11 ilustra como los fibroblastos nativos crecen en un Medio de Eagle, luego de colocar el material dental sobre el cultivo, si las células son capaces de crecer en el gel de agar, las células fueron mutadas por el material, por lo que se concluye ya que el material es un potencial cancerígeno.  

Es importante mencionar que aunque la mayor parte de las pruebas de Mutagénesis y carcinogénesis son realizadas In Vitro, también se mide el aumento en la inducción tumoral por reacciones químicas cuando los materiales son evaluados en animales por otra serie de pruebas que se van a mencionar a continuación.

Pruebas In vivo (en animales)

Se realizan directamente sobre mamíferos como  ratones, ratas, hamseters y conjillos de indias, aunque se utilizan muchos otros animales. Se mide la  alteración en la fx hepática y el aumento en  en la inducción tumoral por una reacción química.

Estas son diferentes a las Pruebas de uso (realizadas en algunos casos en animales), ya que el material no es colocado en el animal para observar su uso final. 


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Imagen 12 
tomada de www.boulesis.com/.../ bioetica/conclusion/

Mostrando un estudio in vivo realizado en una rata

Figura 12








La gran ventaja de estos ensayos es que permiten muchas interacciones complejas entre el material y un sistema biológico funcional, por ejemplo, se puede generar una respuesta inmune o del sistema de complemento, difícilmente recreado en un ensayo In Vitro. Lo que permite la obtención de resultados más relevantes (5).

Estas pruebas presentan la desventaja que los resultados son difíciles de interpretar y controlar. Además son muy costosas, se demoran mucho tiempo, e involucran muchos aspectos ético-legales (5).

Prueba de Irritación de mucosas

Determina si un material puede generar inflamación a nivel de mucosas o piel erosionada. El ensayo se realiza colocando el material a evaluar, además de los controles positivos (+) y negativos (-) sobre la mejilla de un animal, en estos casos se utilizan preferiblemente animales pequeños como por ejemplo el hámster, rata o conejo. Luego de varias semanas de estar en contacto con el material los animales son fotografiados y luego sacrificados para llevar acabo los respectivos estudios histopatológicos del tejido y así determinar finalmente  la respuesta inflamatoria que generó el material (Imagen 13).


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Figura 13



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