Unidad introducción a la bacteriología clínica




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1.9 Técnicas de Tinción Bacteriana.

Los colorantes fueron usados por los microscopistas para mejorar el contraste entre los objetos que se observaban y el medio que los rodea. Los colorantes son substancias que originalmente se derivaron de las anilinas o del alquitrán: químicamente están constituidos por uno o más anillos aromáticos, los cuales tienen diversos sustituyentes llamados cromóforos que le dan la cualidad del color, estos compuestos tienen la capacidad de transferir el color a otras estructuras por lo que reciben el nombre de cromógenos; además tienen un grupo funcional ionizable, llamado auxócromo, que les permiten la unión con estructuras de carga contraria presentes en las células, tejidos o bacterias a teñir.

La mayoría de los colorantes tienen alguna afinidad específica por algún componente celular. Existen varios tipos de colorantes, pero los más usados en microbiología son: las sales colorantes y los colorantes liposolubles;
a) Sales colorantes:

Los colorantes más usados son sales que pueden ser de tipo ácido o básico, términos que no indican necesariamente su pH en solución, sino que una parte significativa de la molécula sea aniónica o catiónica. Los colorantes básicos consisten en un catión coloreado unido a un anión incoloro. Ej: clorhidrato (-) de azul de metileno (+). Los colorantes ácidos tienen el catión incoloro unido a un anión coloreado. Ej: eosinato (-) de sodio (+). Los colorantes se combinan químicamente con el protoplasma bacteriano; si la célula no ha muerto, el proceso de tinción la mata. La célula bacteriana posee constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos, y ellos son los más usados en citología bacteriana. Las bacterias son ricas en ácidos nucleicos que poseen cargas negativas en forma de grupos fosfatos. Los colorantes básicos tiñen la célula bacteriana uniformemente, a menos que antes sea destruido el ARN del citoplasma. Los colorantes ácidos no tiñen la célula bacteriana, y por lo tanto, pueden usarse para impartir al fondo un color de contraste (coloración negativa).Desde el punto de vista práctico entonces, los colorantes básicos tiñen estructuras de naturaleza ácida, como la cromatina nuclear de las células eucariotas y procariotas; los colorantes ácidos reaccionan con sustancias básicas, como las estructuras citoplasmáticas de las células eucariotas.
b) Colorantes liposolubles

Los colorantes liposolubles se combinan con los componentes lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización de los depósitos de grasa. Ej. Negro Sudán. En algunos casos se usan mordientes con la finalidad de engrosar estructuras muy finas, con el propósito de hacerlas visibles al microscopio óptico; uno de ellos es el ácido tánico que se emplea en la coloración de flagelos y espiroquetas.
Las técnicas de tinción se usan en bacteriología se desarrollaron como una necesidad para poner de manifiesto a las bacterias y sus estructuras.

Elaboración de un Frotis bacteriano.

Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber.

Preparación del frotis bacteriano a partir de diferentes muestras.  

El frotis bacteriana debe representar fina monocapa representativa de la muestra:
Hisopos: Hacer rodar ligeramente sobre el porta para evitar la destrucción de elementos celulares y bacterias. Dejar secar al aire.

Aspirados, exudados, esputos, heces (muestras sin hisopo):   seleccionar las partes más purulentas y/o hemáticas, y tras depositar una pequeña fracción de muestra sobre el portaobjetos, con una asa, hisopo o aplicador estéril realizar el frotis.

LCR y otros líquidos que requieren centrifugación: tras centrifugación (2.500-3.000 rpm durante 15 min.), desechar el sobrenadante y utilizar el sedimento (0,5 ml), homogeneizándolo, verter una gota en un portaobjetos y dejar secar al aire. Puede añadirse, opcionalmente, una segunda gota a la primera ya seca para aumentar la sensibilidad.

Orina:   sin centrifugarla, homogeneizar y depositar una gota sobre el portaobjetos realizar frotis con el asa y dejarlo secar al aire.

Cultivos líquidos (hemocultivos, cultivos bifásicos de Castañeda):   depositar con una pipeta Pasteur o con jeringa-aguja estériles, 1 ó 2 gotas en el portaobjetos y hacer una extensión fina con la ayuda de otro porta y dejar secar al aire. Los cultivos en medio líquido solo requieren introducir el asa estéril al tubo tomar una asada y realizar el frotis sobre el portaobjetos dejándolo secar al aire.

Colonias en medio sólido:   colocar 1 gota de agua o solución salina en un portaobjetos, depositar con un asa una carga bacteriana representativa y realizar el frotis, dejar secar al aire.

Métodos de fijación.

Los métodos de fijación que se pueden utilizar son el calor al pasar directamente a la flama del mechero tres veces con un movimiento rápido sin dejar el portaobjetos por más de un segundo. Otro método para fijar un frotis es cubrirlo con etanol o metanol al 70% y dejarlo al menos por 5 minutos y seguir la tinción hasta que se evapore por completo y el frotis y quede completamente seco.

Tinción simple.

En este tipo de tinción se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad. (Azul Metileno de Loëffler, Azul de lactofenol). Esta tinción es utilidad para poder observar la presencia de bacterias así como para poder observar su morfología microscópica.

Tinciones Diferenciales.

Estos tipos de tinción nos permiten clasificar a las bacterias en grupos dependiendo de sus características estructurales de la pared bacteriana.

Tinción de Gram.

Debe su nombre al Bacteriólogo Danés Christian Gram que la desarrollo en 1844. La tinción de Gram se utiliza para clasificar bacterias en dos grandes grupos bacterias Gram positivas y Bacterias gram negativas. A nivel del laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clínica.

Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas (–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared bacteriana.

Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano por lo que no son afectadas por la decoloración con alcohol-acetona, reteniendo el complejo colorante-mordente (cristal violeta-lugol) y visualizándose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular está intacta o dañada por tratamientos con antibióticos o edad celular.

Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de péptidoglucano ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana permite la decoloración con por el alcohol-acetona, permitiendo que el complejo cristal violeta-lugol salga de las bacterias y sea reemplazado por el colorante de contraste (safranina) adquiriendo una tonalidad rosa o rojiza.

Técnica de tinción

  1. Colorante primario Cristal violeta, 1 minuto y enjuagar con agua.

  2. Mordente Lugol, 1 minuto y enjuagar con agua.

  3. Decolorante, alcohol-acetona, 20 segundo o hasta ver los últimos hilos de color morado. Enjuagar con agua.

  4. Colorante de contraste, Safranina 1 minuto, enjugar con agua y dejar secar.

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Bacteria Gram Positiva

Bacteria Gram Negativa

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/morfología%20ultramicroscópica%20de%20las%20bacterias%20estructuras%20internas_archivos/pared_gp_p.gif

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/morfología%20ultramicroscópica%20de%20las%20bacterias%20estructuras%20internas_archivos/pared_gn_p.gif

Tiene una capa gruesa de peptidoglicano (mureina) y dos clases de ácidos teicoicos. Ácido Lipoteicoico que está en la superficie, empotrado en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplásmica. Y ácido teicoico de la pared que está en la superficie y se une sólo a la capa de peptidoglicano.

Tiene una capa delgada de peptidoglicano (mureina) unida a una membrana exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína, fosfolípido y lipopolisacárido.




Tinción de Ziehl Neelsen.

También es una tinción diferencial. Se denomina tinción ácido-alcohol resistente y es específica para una serie de bacterias con estructura de pared particular, las Mycobacterias. La pared de las Mycobacterias no está basada en peptidoglicano como las bacterias gram positivas y gram negativas, la diferencia radica en la presencia de ácidos grasos (ácidos micólicos). Esta particularidad las hace resistentes a la decoloración con alcohol-ácido. Esta característica también se puede observar en bacterias del genero Nocardia sp y en algunos parásitos (Coccidias intestinales).

Las bacterias BAAR (+), adquieren una coloración rojiza por retener a la fuccina fenicada, mientras que las bacterias BAAR (-) se observan de color azul por acción del azul de metileno.

La tinción clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentar la fuccina fenicada hasta emisión de vapores para que el colorante atraviese la pared bacteriana. Se ha desarrollado una modificación a la técnica de tinción tradicional de Ziehl-Neelsen, la técnica de Kinyoun en la que se sustituye el calentamiento hasta emisión de vapores de la fuccina fenicada, colocan el frotis en un vaso para tinción con fuccina fenicada durante 20 a 25 minutos o cubrir el frotis durante 5 minutos con fuccina Kinyoun (Carbolfuccina), colocando un trozo de papel filtro para evitar la precipitación del colorante, una vez transcurrido este tiempo se continua la tinción de la misma manera que en la técnica de Ziehl-Neelsen.

En ambas imágenes se observan bacilos BAAR(+) de color rojo y cocos BAAR (-) de color azul.

Técnica de tinción.




Tinciones especiales.

Las tinciones especiales nos permiten poner de manifiestos elementos estructurales de las bacterias:

Tinción negativa

Este procedimiento consiste en la tinción del fondo del campo visual con un colorante ácido para dejar las células incoloras en contraste. Comúnmente se utiliza el colorante negro llamado nigrosína o tinta china. El método sirve para observar bacterias o estructuras que difícilmente se tiñen con las técnicas diferenciales, como los espirilos y las espiroquetas.

Tinción de los flagelos

Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser visibles en el microscopio de luz. Sin embargo si se tratan con una suspensión coloidal inestable de sales de ácidos tánico para formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos, se pueden poner de manifiesto su presencia y disposición en las células. De esta manera el diámetro aparenta que la estructura aumento de tamaño con fuccina básica los hace visibles en el microscopio óptico.

Tinción de la cápsula

Uno de los métodos de ´´ tinción de la cápsula ´´ incluye el tratamiento de las bacterias con un solución caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una solución de sulfato de cobre. El sulfato de cobre también imparte color al fondo y esto resulta en que la célula y el fondo aparezcan teñido en color azul oscuro mientras la cápsula aparece de color azul pálido. Otro método utilizado para observar capsula es la tinción negativa o tinta china, mediante la cual se realiza la observación de muestras de líquido cefalorraquídeo para la búsqueda de levaduras de Cryptoccocus neoformas, hongo dimórfico causante de la Criptococosis.

Tinción del núcleo

Los núcleos se pueden teñir por la tinción de Feulgen la cual es específica para el ADN.

Tinción de esporas

Las esporas se observan de la manera más simple como cuerpos refringentes intracelulares en suspensiones de bacterias sin teñir, la parte de las esporas relativamente impermeable, las esporas comúnmente se tiñen con verde de malaquita y carbolfuccina.
1.10 Medios de Cultivo bacterianos.

Medio de cultivo. Son ambientes que contienen los elementos nutritivos y las condiciones físico-químicas que permiten el desarrollo, crecimiento, conservación y estudio de los microorganismos.
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica debe contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para que las reacciones metabólicas se puedan llevar acabo.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaba la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por su capacidad de ejercer un efecto inhibidor selectivo de ciertos microorganismos.
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