Rama de la biología que se ocupa del estudio de los microorganismos, sus actividades y sus relaciones con el entorno




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G = (t1 – t0) / nº de generaciones


Cada vez que una célula se divide duplica su número. El número de generaciones es igual a:

Nº de generaciones = log2 (N1 / N0) = log2 (N1) – log2 (N0)

siendo

N1 = nº de bacterias a t1

N0 = nº de bacterial a t0



Ej.:

Tiempo

T0







T1

Nº bacterias

2

4

8

16

Nº generaciones

1

2

3

4


Nº de generaciones = log2 (16 / 2) = 4 – 1 = 3
Para saber el nº de bacterias que hay en un cultivo se usa el método del contaje microscopico directo.

La cámara esta hecha para que por capilaridad entre siempre el mismo volumen por ej. 1 ml. Se cuentan las bacterias que hay en 1 ml por cuadrado.

Se cuentan algunos cuadrados separados entre sí, y se estima una media relevante.
Factor de multiplicación de la cámara x volumen de dilución = nº de bacterias
Este método es seguro pero puede ser engañoso.

Hay también métodos indirectos:

  1. Mediante cultivos patrones hace relación entre volumen celular y nº de células, de forma que sabemos que 1 gramo = 1012 unidades. Esto va a depender del propio tamaño de la bacteria por lo que habrá que hacer una curva patrón para cada bacteria.

  2. Turbimetría.- La medida de la turbidez del medio está relacionada con el nº de bacterias que hay en él.

En el método de contaje directo no distinguimos si las bacterias están vivas o muertas (en su aspecto, tamaño, absorción… no se distinguen).

Todos estos métodos numeran todas las células estén muertas o vivas.
CRECIMIENTO MICROBIANO

La capacidad de una bacteria de modificar su entorno es muy pequeña, por eso en microbiología se trabaja con poblaciones microbianas. De estas poblaciones sólo nos interesan aquellas células capaces de creas progenie a las que llamamos unidades formadoras de colonias (UFC). Las UFC se determinan tomando la muestra, se diluye y se coloca en una placa. Tiene que estar suficientemente diluida para que las células se separen y la probabilidad de que dos células queden juntas sea menor.

Cuando se determina el crecimiento microbiano en tubo cerrado se obtiene la curva de crecimiento microbiano. Se trata de una campana de Gauss en la que distinguimos varias fases:



  1. Fase A-B

Es la fase lag (de adaptación). Las bacterias del cultivo tienen que reconocer y adaptarse al nuevo entorno.

  1. Fase B-C

Es la fase logarítmica, exponencial o de crecimiento. Las bacterias crecen a costa de consumir nutrientes y excretat sustancias tóxicas. Llega un momento en que la disponibilidad de nutrientes es menor y aumenta la [ ] de sustancias tóxicas con lo que algunas bacteria mueren.

  1. Fase C-D

Es la fase estacionaria en el que el número de bacterias que mueren y el número de bacterias que se dividen se iguala.

  1. Fase D-E

Es la fase de muerte celular. La división de las bacterias se hace más lenta por acumulo de sustancias tóxicas. Las diferencias individuales entre las células empiezan a tener valor porque es importante el comportamiento frente al medio de cada una de las células que van quedando.
Si determinamos el nº de células totales las primeras fases de la curva son iguales, pero a partir de C el nº de células sigue aumentando aunque cada vez lo más lentamente porque algunas células han dejado de dividirse.

Si cultivamos bacterias con un aporte continuo de nutrientes y retirando las sustancias tóxicas, en principio estas bacterias no dejarían de crecer.

En bacterias gram – se descubrió una reacción llamada respuesta general de estrés que consiste en una respuesta biológica en la que las bacterias disminuyen su velocidad de división y su crecimiento haciéndose, de esta forma, un poco más resistente a la situación de estrés.
Fases del crecimiento bacteriano (nivel celular)

Cada bacteria necesita un determinado espacio biológico para cada unidad. Si las condiciones de crecimiento no valen ni siquiera en laboratorio cuando las condiciones del medio como consecuencia del espacio, en el organismo las condiciones son muy cambiantes y desfavorables (respuesta inmune); por ello interesa saber que pasa en cada bacteria a nivel individual.

Cuando una bacteria inicia su división ya no hay marcha atrás por lo que en un cultivo vamos a distinguir:

  1. Células en reposo

  2. Células con inicio de proceso de crecimiento y división.

Las bacterias A con el tiempo pasan a una situación B. Tras la división las células hijas también pasan al estado B; y ello constituye la fase logarítmica del crecimiento microbiano.

En respuesta a condiciones ambientales desfavorables, la bacteria entra en estrés: en ESTASIS: limitan su metabolismo, crecen menos pero no pierden si capacidad de división aunque lo hacen lentamente. Algunas se dividen antes de completar su crecimiento y, como consecuencia, las células nuevas tienen menos riqueza en estructuras metabólicas.

Las células en estasis pueden entrar en fase A o directamente en fase B.

En algunas bacterias se ha descrito un estado de DORMANCIA, un estado similar a endospora (la célula no se divide y su metabolismo es muy lento). Si a una célula en dormancia si añadimos un sobrenadante de células en fase exponencial, se despiertan y pasan a fase A o fase B (explicarían las infecciones recidivantes, por ej. en la tuberculosis).


La duración de la fase logarítmica tiene importancia en el control de seguridad de los alimentos, instrumentos quirúrgicos…
MEDIOS DE CULTIVO

Es el conjunto de sustancia que permiten el crecimiento microbiano en el laboratorio.

Distinguimos:

  1. Caracteres físicos

  2. Propiedades biológicos


Caracteres físicos

Pueden ser sólidos, líquidos y semisólidos, cada uno de ellos diferentes y con aplicaciones propias y características.

  1. Medio sólido.- Sirve para aislar. Se extienden las bacterias por la placa y las bacterias no se mueven.

  2. Medio líquido.- Para purificar una bacteria alterada genéticamente para producir insulina.

  3. Medio semilíquido.- Sirve para medir el grado de movilidad de una bacteria.


Una bacteria inmóvil en un medio líquido se va a caer hacia abajo por la gravedad. Si está en un medio sólido las bacterias tampoco se mueven mucho a partir del movimiento flagelar. En un medio semisólido el movimiento flagelar no se puede anular, aunque si que da anulado el movimiento gamniano.
Propiedades biológicas

Diferenciamos:

  1. De transporte

Son las propiedades del medio necesarias para transportar la muestra desde el lugar de toma de la muestra hasta el laboratorio. En ese tiempo hay que protegen la muestra:

    • Mantenimiento de un ambiente húmedo (con gel aggar)

    • Eliminación de productos tóxicas

    • Nutrientes que permitan su supervivencia

    • Si se trata de bacterias anaerobias también hay que evitar que el O2 sea absorbido para que no llegue a la bacteria (con gliocolato).

  1. Generales o de soporte

Sólo se necesitan nutrientes básicos (iones, oligoelementos, fuente de carbono, fuente de energía…).

  1. Enriquecido

Son microorganismos exigentes (en inglés fastidious) que necesitan nutrientes especiales para su crecimiento y que son incapaces de formar: son auxotrofos para alguna sustancia.

Son nutrientes generales al que añadimos este nutriente específico. Si se desconoce cual es el nutriente específico se usa un medio aggar sangre: un medio aggar al que se le añade un poco de sangre de ternera… donde podemos encontrar de todo: factores hormonales, lípidos, iones…

  1. Selectivos

Impiden el crecimiento de algunos microorganismos y permiten el de otros.

Ej.: el medio de Levine?? impide el crecimiento de bacterias gram + al pegarse a su pared, las bacterias gram – pueden crecer en este medio porque tienen una gruesa pared de mureína que las hace más resistentes.

  1. Diferenciales

Distinguen microbios en función de alguna característica. Permiten el crecimiento de todos los microorganismos pero permiten distinguir aquellos con alguna característica especial, estos últimos crecen más.

DIA 31/11/2007
GENÉTICA BACTERIANA

Deben tener equilibrio entre descendientes y progenitores y tienen que adaptarse al ambiente. Las ventajas frente al ser humano, son fundamentalmente:

  • Modificaciones de bacterias que se expresan en descendientes más rápidamente porque hay muchas generaciones en un pequeño periodo de tiempo, las mutaciones por tanto son más rápidas.

  • Las bacterias son haploides, si se produce una mutación en un gen, la modificación es absoluta en él. En eucariotas se enmascara por la presencia del otro gen.


Hay variabilidad genética que se ve en las características externas de las poblaciones:

1. Variabilidades genotípicas: aparecen lentamente, son irreversibles ya que afectan las secuencias del ADN. Están causadas por mutaciones puntuales (alteración de información genética durante la replicación), reordenamiento (alteraciones en la estructura del genoma bacteriasno) y recombinación (intercambio entre dos individuos).

2. Variabilidades fenotípicas o modificaciones: no afectan a secuencias de DNA sino a cómo se expresa la sec de DNA en el ambiente. Son reversibles y aparecen bruscamente. Por ej: expresión de operones. Debidas a regulación alostérica, regulación de la expresión génica y variación de fase. Ejemplos: flagelina 1 y 2, operón lactosa, cápsula y expresión de sustancias tóxicas durante la infección de un organismo.

La causa de variabilidad genética más común es la mutación: cambio en la secuenciación de bases. Se pueden clasificar según el efecto en el fenotipo en:

  1. Silenciosas: alteran la secuencia pero da codones sinónimos. Fenotípicamente es igual.

  2. Neutras: la mutación cambia el codón y también el aminoácido, pero éste es químicamente similar al sustituido y la función no cambia. El fenotipo de la proteína sería distinto, pero no el comportamiento de la bacteria.

  3. Expresadas: se produce un cambio de codón, que da lugar a un distinto aa y a una distinta función de la proteína.

    1. No selectivas: no permiten selección.

    2. Selectivas: permiten hacer selección de bacterias en base a alguna propiedad, como por ejemplo si son o no resistentes a antibióticos

    3. Letales: la célula no es viables

      1. No condicionales: siempre son letales

      2. Condicionales: sólo son letales en determinadas circunstancias. Por ejemplo: mutantes térmicos, que sólo mueren al superar cierta temperatura. Puede que una mutación baje la resistencia de las proteínas y se desnaturalicen antes por calor.



Las mutaciones se producen por cambios en secuencias de bases y estas modificaciones pueden ser:

Puntuales (cambios de una base)

Delecciones (por acción de la ADN polimerasa)

Inserciones (introducción de secuencias)
Puntuales: debido a la degeneración del genoma y a la teoría del balanceo (sólo importan 2 pares de bases para la síntesis de proteínas) suelen ser silentes. El problema está en si se crea un codón sin sentido (un codón stop), ya que la proteína sería ineficaz. Las puntuales son las más frecuentes, se producen en la replicación.
Delecciones: por error en la replicación o por daño físico al DNA.

Dentro de las inserciones pero más frecuentemente de las delecciones pequeñas, es fácil que la ADN polimerasa se salte una base, pero esto es muy importante porque afecta al marco de lectura y además afecta a más de una proteína según donde se produzca, ya que el genoma bacteriano es policistrónico. Esto se llama polaridad de la mutación.
Inserciones: debidas a la presencia de secuencias en el DNA que pueden cambiar de sitio: son secuencias cortas (aproximadamente de mil pares de bases), sólo codifican resolvasas (enzimas y proteínas para hacerse móviles) y transposasas (enzimas que llevan a otros sitios a las secuencias móviles del DNA).

Las resolvasas reconocen secuencias en los extremos de estas secuencias móvil, que son secuencias repetidas pero invertidas, las corta y ya pueden ser llevadas a otras secuencias.

MECANISMOS BACTERIANOS ANTIMUTACIÓN

Estos mecanismos deben mantener un equilibrio entre la variabilidad genética y estabilidad genética.

Al producirse las mutaciones las bacterias tienen mecanismos para revertir los efectos:

  1. Reversión espontánea: divisiones posteriores pueden volver a cambiar la base nitrogenada y volver a la normalidad (regresión directa o retroceso), o que este cambio haga alguna mutación silente o neutra (mutación supresora).

  2. Reparación del DNA:

-enzimas específicas que lo reparan. Por ejemplo, la radiación UV forma dímeros de timina, un complejo enzimático los reconoce y los corta. Este mecanismo ocurre cuando se expone a la luz y luego a la oscuridad (fotoactivación y reparación en la oscuridad).

-sistema de escisión de reparación (operón MUT): su proteína reconoce las bases de los extremos de una secuencia donde no hay apareamiento entre ambas hebras y los corta. Este mecanimo es post-replicación. El DNA original tiene los puntos de corte bloqueados (porque está metilado), por eso esta hebra (la original) no es cortada. Para el corte de la hebra se utilizan endonucleasas.

-operón REC:

•sistema SOS: actúa cuando se detectan segmentos largos de DNA monocatenarios. Es un sistema de emergencia. Este sistema puede producir mutaciones al solucionar esto, pero siempre son menores a lo solucionado (compensa).

•recombinación: permite rellenar huecos vacíos de DNA.

El sistema REC lleva la hebra A (que es igual a la B) al sitio de la B, ahora el hueco vacío donde estaba A puede volver a ser ocupado por la misma hebra porque es resintetizada a partir de la hija.

RECOMBINACIÓN GENÉTICA

Es el intercambio de información genética entre dos individuos distintos. Ejemplo: reproducción sexual. Dos bacterias pueden intercambiar parte de la información genética. Esta parte intercambiada se llama exogenonte, y la bacteria que la acepta se llama endogenonte. El endogenonte puede:

-destruir el exogenonte mediante endonucleasas por ser extraño

-recombinarse con exogenonte si es parecido. Puede ser:

•generalizada (transformación, transducción genética). Puede ser (en base a si los individuos se parecen o no):

Homóloga (legítimo): cuando el ADN es equivalente.

Heteróloga (ilegítimo): cuando los segmentos no son iguales.


      • específica de sitio (transducción espontánea, conversión génica).

      • reordenación (transposición)

      • replicarse independientemente del exogenonte (plásmidos y transposones replicativos).

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