Reactivación del cultivo de referencia




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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA
Nombre: Gabriela Pita

Fecha: 27-03-2011
Tema: Cultivos de referencia
Fundamento Teórico

Los laboratorios de microbiología deben tener cultivos de referencia certificados por una(s) colección(es) de cultivo(s) reconocida(s) nacional o internacionalmente. Estos cultivos de referencia deben ser manipulados y preservados de forma tal que sus características fenotípicas y genotípicas originales permanezcan inalteradas.

El procedimiento se fundamenta en la reactivación de los cultivos de referencia certificados (liofilizados o congelados), a través de la utilización de medios de cultivo específicos, incubando a la temperatura y tiempo establecido para cada microorganismo.
Reactivación del cultivo de referencia

  • Reactivar los cultivos de referencia (liofilizados o congelados), estas son almacenadas entre 0-5 º C hasta su uso.

  • En la reconstitución y siembra de la Cepas de referencia, se utiliza el medio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las disposiciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de las cepas

  • .Preparar subcultivos en fase estacionaria, e incube a la temperatura y tiempo adecuado.

  • Subcultivar en medio sólido y líquidos selectivos y no selectivos.

  • Registrar las características morfológicas y fisiológicas (utilice métodos convencionales y/o rápidos para la identificación de microorganismos).

Nota: si las características del cultivo no cumple con las especificaciones, descártelo y comuníquelo a la institución de origen.

  • Elaborar cultivos de reserva a partir del cultivo obtenido y preservar según los métodos descritos. Se deben rotular con el nombre del microorganismo, número de identificación y fecha. Mantener los registros del número de cultivos de reserva preparados por lote.

  • Elaborar los cultivos de trabajo subcultivando uno de los cultivos de reserva. Identificar con el nombre del microorganismo y el número de lote.


Métodos de preservación

Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas microbianas en los laboratorios de microbiología son: que el cultivo a conservar sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación; que durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y por último, que estas células permanezcan genéticamente estables.
Método de preservación: Congelación

  • Preparar dos o más repiques del cultivo de referencia certificado, en medio sólido e incube por el tiempo y temperatura apropiados para el microorganismo procesado. La cantidad de placas y/o tubos de agar no selectivo a obtener a partir de la cepa de referencia estará relacionado con la cantidad de crioviales que se necesiten almacenar.

  • Añadir 2,0 ml del agente crioprotector estéril (caldo BHI con glicerol 20%, caldo nutritivo con glicerol 50% o glicerol al 10%) al cultivo.

  • Raspar la superficie del cultivo, utilice un aplicador de madera o perlas de vidrio estériles para preparar una suspensión de por lo menos 107-108 cel / ml.

  • Dispensar alícuotas de 0,1-0,2 ml en criotubos de 2,0 ml estériles previamente rotulados con los datos del cultivo.

  • Colocar los tubos inmediatamente a las temperaturas de congelación. Cuando el laboratorio no dispone de equipos que alcancen temperaturas de -70, las suspensiones deben elaborarse en caldo nutritivo con 50% de glicerol para que puedan ser almacenadas a -20°C.

  • Si el almacenamiento utilizado es de - 70ºC, se puede realizar la congelación en dos pasos, primero a - 20 ºC y luego a - 70 º C, para evitar choque térmico.

  • Realizar controles de viabilidad: cultivar el microorganismo en medios nutritivos antes y después del proceso.


Método de preservación: Temperatura ambiente

  • Preparar los repiques del cultivo de referencia certificado en tubos tapa de rosca, rotulados y con medio sólido de agar tripticasa de soya e incube por el tiempo y temperatura apropiados para el microorganismo procesado.

  • Luego de incubar, añadir una capa de aceite mineral o parafina estéril que cubra todo el cultivo hasta 1,0 cm por encima de la superficie del agar.

  • Sellar el tubo con papel parafilm y almacene a temperatura ambiente.

  • Realizar controles periódicos de pureza y viabilidad.


Transferencia periódica

  • Preparar subcultivos del cultivo de referencia certificado en tubos tapa de rosca, con medio agar tripticasa soya.

  • Incubar por el tiempo y temperatura apropiados para el microorganismo procesado.

  • Mantener entre 4 ºC – 8 ºC. Realizar controles periódicos de pureza y viabilidad


Control de calidad de pureza y viabilidad:

Este control se realiza a diferentes niveles del proceso; asimismo, se desempeña cada vez que se realiza un replique. El objetivo de dicho control es el de asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.
PUREZA

La preparación de cultivos puros se lleva a cabo convenientemente aislando colonias en medios nutricios selectivos y precediendo después a su cultivo. Repitiendo este proceder varias veces (como mínimo tres) puede asegurarse que el microorganismo está en cultivo puro.
DESARROLLO


  • Se reactiva la cepa del congelador en un medio de baja selectividad, se incuba a 37ºC durante 24 horas.

  • Se realiza siembras por técnica de vertido con diferentes diluciones en medios de baja selectividad (TSA, PCA) y AS.

  • Se elige aquellos grados de dilución con los cuales sea posible aislar colonias independientes.

  • La toma y siembra de la colonia aislada desde la placa original se lleva a cabo con ayuda de un asa.

  • Se utiliza la técnica de estriado en medios no selectivos (agar nutritivo, TSA, PCA).

  • Con colonias bien aisladas se realiza una tinción gram para comprobar su purificación.



VIABILIDAD

Se evalúa mediante la enumeración (cuenta indirecta) de las colonias que aparecen sobre el medio, después de sembrar una serie de diluciones sucesivas de la suspensión original e incubándolas, durante el tiempo necesario. El porcentaje de viabilidad, se determina mediante la relación del número de bacterias viables determinadas al tiempo del muestreo, con respecto a aquellas determinadas al inicio del período de conservación.
DESARROLLO


  • Cuando esta la cepa pura se procede a congelar en crioviales, previo a esto se cuantifica los microorganismos.

  • Se realiza un inóculo de la cepa en BHI durante 24 horas, se siembra por vertido con diferentes diluciones (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6), se incuba las cajas 24 horas a 37ºC.

  • Se realiza un contaje de las cajas que tengan colonias en un rango de 30 – 300, y se multiplica por el factor de dilución, este es el valor de referencia.

  • Realizar el mismo procedimiento de las cepas cada mes para comprobar la viabilidad.



Viabilidad = número de colonias al tiempo de muestreo x 100

Número de colonias al inicio de la conservación
IDENTIFICACION

La identificación de una bacteria es su asignación a un taxón según una clasificación dada. Consiste en la determinación de las características fenotípicas y/o genotípicas y la comparación de estas características con los diferentes taxones de la clasificación considerada.  Las características a determinar y su número depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificación.
DESARROLLO

  • Obtener un cultivo puro

  • Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

  • Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.

  • Realización de pruebas primarias: 

En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento.

Las pruebas primarias son: 

  • Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)


Enriquecimiento y aislamiento de bacterias acéticas

Se somete a las muestras a medios de enriquecimiento para asegurar la selección de las bacterias acéticas en el medio de Hoyer
Inocule las muestras en dos tubos del medio de Hoyer Incube a 30º C durante 48 horas, en sheiker orbital a 200 rpm. Observar los tubos de Hoyer. Si algo creció en ellos, estríe para el aislamiento sobre el medio YGC. Incube a 30º C durante 48 horas
Observe las morfologías de la colonia. Si hay tipos distintos de colonias sobre los platos, tome de cada colonia y estríe para el aislamiento sobre los platos de YGC. Incube a 30º C durante 48 horas. Si hay un sólo tipo de morfología en las colonia, seguir a las pruebas.

Medios específicos para acetobacter aceti

Medio Manitol, acetobacter puede distinguirse en laboratorio por el crecimiento de colonias en un medio conteniendo 7 % etanol y suficiente carbonato de calcio para hacer al medio parcialmente opaco. Cuando las colonias de Acetobacter forman suficiente acético del etanol, el carbonato cálcico (CO3Ca) alrededor de las colonias se disuelve, formando una zona clara muy apreciable.

Método de Selección y Propagación

Para la selección de las cepas con mayor poder de oxidación elaboraremos medios con las siguientes concentraciones de Etanol 0.2, 0.4, 0.6 y 0.8% respectivamente. Por lo tanto la selección se efectuará en el medio de cultivo con estas concentraciones.

Los microorganismos seleccionados serán puestos nuevamente en un medio minimal líquido y sólido, con la diferencia de que esta vez el medio base contendrá como fuente de carbono Etanol que van a ser oxidado. Después de sembrar los microorganismos seleccionados estos deberán permanecer por lo menos cuatro o cinco días a temperatura ambiente para su crecimiento.

Análisis de la morfología microscópica

A cada una de las cepas aisladas se les realizará tinción Gram para observarlas al microscopio. Y se observará como crecen en el medio de cultivo.

Pruebas bioquímicas.

Entre las pruebas bioquímicas más comunes, se encuentran:

  • Catalasa. En portaobjeto, se extiende una porción de la cepa con aza previamente esterilizada y se agrega H202 oxigenada.

  • Oxidasa. En papel filtro, se deposita una porción de la cepa con rastrillo y sobre ésta se agrega reactivo oxidasa.

  • Tinción de Gram. Para esta tinción, se utiliza portaobjeto, donde se extiende una pequeña porción de la cepa. Luego se tiñe con: violeta genciana o cristal violeta, lugol (yodo-yodurada), alcohol acetona y finalmente fucsina.

  • Indol. La bacteria se cultiva durante 48 h, en un caldo triptona con NaCl 0,5% y se utiliza reactivo de Kovacs para observar si se cumple o no la prueba.


BIBLIOGRAFÍA:


  • Norma del Codex para el vinagre stan 162-1987

  • LLAGUNO C. y POLO C. 1991. El vinagre de vino. Consejo Superior de

  • Investigaciones Científicas. Madrid. España. 238 p.

  • MARÍA DOLORES GARCÍA LÓPEZ Y FEDERICO URUBURU FERNÁNDEZ. La conservación de cepas microbianasColección Española de Cultivos Tipo (CECT). Universitat de València. 46100 Burjassot (Valencia)

  • http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S1561-

  • 30032005000200005&script=sci_arttext&tlng=en

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