Centro universitario de la costa




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CENTRO UNIVERSITARIO DE LA COSTA

CAMPUS PUERTO VALLARTA

LIC. EN MÉDICO CIRUJANO Y PARTERO

BIOLOGÍA MOLECULAR

DR. JUAN FRANCISCO LLAMAS

PRESENTAN:

  • BARRIENTOS RUIZ FANNY

  • FLORES PELAYO SUSANA

  • MARTÍNEZ PADILLA JAVIER ALFONSO

  • TREVIÑO PÉREZ CARLA JANET

SECUENCIACIÓN Y RATONES TRANSGÉNICOS

SECUENCIACIÓN

Método preciso para determinar el orden o secuencia en que se encuentran dispuestos los nucleótidos en una cadena de DNA.

En 1977, F. Sanger y W. Gilbert publicaban de forma simultánea un método eficaz de secuenciación conocido actualmente como método enzimático y método químico respectivamente. Ambos métodos se basan en la obtención de una colección de moléculas de DNA de distinto tamaño y con un extremo 3’ específico, se diferencian en la forma en que se obtienen estos extremos.

El principio fundamental del método consiste en la síntesis in vitro de una cadena complementaria al DNA que se pretende secuenciar en unas condiciones tales que se pueda detener el crecimiento de modo controlado en posiciones específicas. Esto requiere la hibridación de un oligonucleótido cebador a una cadena sencilla del DNA que se quiere secuenciar, DNA molde.

El iniciador se sintetiza de forma que presente una secuencia complementaria a una región adyacente al extremo 3’ del DNA que queremos determinar, normalmente cerca del sitio de clonaje del vector, por lo que es posible usar un único iniciador para todos los fragmentos de DNA que se desee secuenciar.

El DNA de cadena sencilla puede obtenerse desnaturalizando con álcali el plásmido que lleva clonado el DNA de interés o bien introduciendo este DNA en un fago filamentoso como el bacteriófago M13, el cual produce partículas víricas con DNA monocatenario.

El complejo formado por el iniciador y el molde sirve de sustrato para el fragmento Klenow de la DNA polimerasa I.

En presencia de los cuatro desoxinucleótidos (dNTPs), la enzima inicia la síntesis de una cadena complementaria al molde.

La segunda condición del método es poder controlar la posición en la que finaliza dicha síntesis. Esto se consigue introduciendo una relación adecuada de dideoxinucleótido en la reacción. Los dideoxinucleótidos (ddNTPs) son componentes análogos a los dNTPs, pero que carecen del grupo hidroxilo en la posición 3‘, el cual es imprescindible para la formación del enlace fosfodiéster con otro nucleótido.

Para secuenciar un fragmento de DNA necesitamos realizar cuatro reacciones independientes, cada una de las cuales tendrá una pequeña proporción de un ddNTP específico. La incorporación de este análogo dará como resultado una mezcla de fragmentos de DNA que tendrán un extremo 5’ común (el iniciador) y un extremo 3’ diferente, que coincidirá con todas las posibles posiciones en las que se localiza ese nucleótido en la cadena de DNA. De esta forma, cada reacción nos revela la posición ocupada a lo largo de la cadena de DNA por cada uno de los cuatro nucleótidos.

Para visualizar el resultado de la reacción, el conjunto de fragmentos obtenidos se separa en electroforesis de acrilamida en condiciones desnaturalizantes. Esta técnica de alta resolución nos permite separar fragmentos de DNA de cadena sencilla que se diferencian en un único nucleótido de longitud. Al colocar en el gel las cuatro reacciones de forma adyacente se obtiene una figura de bandas que, al seguirlas de forma escalonada, nos indica la secuencia del fragmento de DNA que se está analizando.

Estrategias de secuenciación

Estrategia que nos permita determinar la secuencia completa a partir de varias reacciones. La estrategia a seguir dependerá del tamaño del DNA que se pretende secuenciar, así como del equipo especializado que se posea.

Secuenciación de fragmentos generados al azar

El fragmento de DNA a secuenciar es fraccionado al azar mediante sonicación o digestión controlada con la endonucleasa DNAsa l. Los fragmentos obtenidos son clonados y secuenciados al azar hasta que se completa la secuencia entera que deseamos determinar.

Subclonaje mediante el uso de enzimas de restricción

Este método requiere un conocimiento previo del mapa de restricción del DNA que se quiere secuenciar. La digestión del DNA con enzimas seleccionadas nos genera fragmentos que pueden ser clonados y secuenciados. La secuencia que se va obteniendo nos proporciona más información acerca de otros posibles sitios de restricción que se desconocían, los cuales pueden ser utilizados para la obtención de nuevos subfragmentos.

Deleción secuencial del fragmento de DNA

Esta estrategia se basa en la obtención de delecíones secuenciales a partir de un extremo del fragmento que queremos secuenciar. Generalmente estas deleciones son generadas enzimáticamente mediante la recogida de muestras a diferentes tiempos de la digestión. Los parámetros de la digestión deben ajustarse con objeto de obtener fragmentos delecionados que se diferencien en aproximadamente 250 nucleótidos. Los productos de la reacción son clonados con el extremo delecionado cerca del sitio de hibridación del iniciador universal; por lo que puede obtener la secuencia entera usando un único.

Secuenciación mediante síntesis de varios iniciadores

Si el DNA que queremos secuenciar puede ser clonado entero en el vector, la secuencia entera del mismo puede ser determinada mediante el uso de varios iniciadores específicos para ese DNA. La primera secuencia obtenida con el iniciador universal es usada para diseñar un oligonucleótido cerca del límite de la secuencia que hemos obtenido y que no posea homología con el vector.

Este nuevo iniciador nos permitirá conocer unos 250-300 nucleótidos más, con lo que podremos diseñar un nuevo oligonucleótido. Este ciclo de secuenciación y diseño de un nuevo iniciador puede repetirse hasta la determinación de la secuencia completa.

Este es el método más eficiente, ya que la información redundante que se obtiene es mínima.

RATONES TRANSGÉNICOS

Organismos transgénicos

  • Organismos vivos (plantas, animales o bacterias) manipulados genéticamente mediante la inserción de un gen que habitualmente no formaba parte de su repertorio genético.

  • El a ser introducido consiste de una región promotora y una región codificante para la proteína de interés.

Métodos de transformación genética en animales

Transformación genética mediante el uso de vectores retrovirales.

Esta se lleva cabo reemplazando genes que no son esenciales para el organismo transgénico por genes que se quieren que se desarrollen para que lleven a cabo una acción determinada. Este método tiene un punto débil puesto la secuencia de genes codificada y transferida al organismo no será heredada a la descendencia.

Transformación genética mediada por semen

Este se lleva a cabo por medio de la inseminación artificial utilizando semen previamente estudiado. Este método es muy cuestionado debido a que su efectividad es muy pobre.

Clonación

Este tema ya se vio con el equipo anterior.

Usos de la tecnología de transferencia nuclear y recombinación homologa en producción animal.

Clonación de animales elite

Se usa para crear animales que fueran de primera calidad en las labores para las que se les tiene asignados.

Conservación genética

Se puede usar para evitar la extinción de una especie determinada o inclusive para mejorar a dicha especie y hacerla más resistente a determinadas situaciones o eventos.

Eliminación de genes (gene knock out)

Aquí se da la combinación de diversos genes en células somáticas previo a la transferencia. Se podría usar en un futuro para realizar trasplantes de animales a humanos sin ningún problema.

¿Cómo se hace un ratón transgénico?

Puede ser de dos maneras:

  1. Inyectando el DNA en huevos fertilizados

Obtener los huevos fertilizados

Son obtenidos a través de las hembras, que fueron inyectadas con hormonas de estrógeno y posteriormente apareadas. Los huevos fertilizados se remueven del oviducto por medio de lavados de solución salina.

Microinyectados dentro del pronúcleo masculinohttp://www.icampus.ucl.ac.be/courses/sbim2520/document/genemol/biomolespa/transgenico/raton-01a.jpg

Unos cuantos cientos de copias del DNA que lleva el transgen, son microinyectados en un volumen de 2-5 picolitros, dentro del pronúcleo masculino, a través de una pipeta de vidrio ultrafina.

Implante de los embrioneshttp://www.icampus.ucl.ac.be/courses/sbim2520/document/genemol/biomolespa/transgenico/raton-01b.jpg

10-20 huevos microinyectados son implantados dentro del oviducto de una madre adoptiva. Las crías de éstos huevos microinyectados nacen 19-21 días después, completando el ciclo normal de gestación de un ratón. Aproximadamente entre el 10-40% de las crías tendrán el transgen integrado en su genoma.

Identificación de los animales transgénicos

Son identificados por el análisis de DNA a partir de un fragmento de la cola del ratón.

Generar individuos transgénicos homocigoto

La finalidad es analizar de qué manera influye en el fenotipo del ratón, el grado de expresión del transgen.

Transgénico fundador

Ratón desarrollado a partir de un huevo inyectado con el DNA transgénico.

  1. Células stem embrionarias (ES cells) son inyectadas en embriones

Inyección de las células stem embrionarias en un blastocisto

http://www.icampus.ucl.ac.be/courses/sbim2520/document/genemol/biomolespa/transgenico/raton-02.jpg

Se microinyectan con 10 a 12 células stem embrionarias modificadas genéticamente y posteriormente son implantados en madres pseudopreñadas.

Germ-line

  • Las moléculas se alinean una con otra en la orientación correcta.

  • Las moléculas de DNA son cortadas y unidas en los extremos que corresponden a las zonas de homología.

  • La secuencia intermedia es reemplazada en el gen endógeno y no sufre ninguna alteración.

Los ratones que nacen son quimeras

Estos ratones presentarán dos tipos diferentes de células; aquellas que corresponden al genoma del ratón original microinyectado, así como las células derivadas de las células stem embrionarias manipuladas, que llevan el gen modificado integrado en su genoma.



Bibliografía consultada:

PREGUNTAS: SECUENCIACIÓN Y RATONES TRANSGÉNICOS

  • ¿Qué es secuenciación?



  • El __________________del método consiste en la _________________de una cadena complementaria al DNA que se pretende secuenciar en condiciones que se pueda detener el crecimiento de modo ____________en____________________.

  • Explica brevemente como se lleva a cabo la secuenciación.



  • ¿Cómo se consigue controlar la posición en la que finaliza la síntesis de secuenciación?

  1. Por la DNA polimerasa I.

  2. Por los desoxinucleótidos (dNTPs).

  3. Por los dideoxinucleótidos (ddNTPs).

  4. Por la síntesis de una cadena complementaria al molde.

  • Los _______________________ son componentes análogos a los dNTPs, pero que carecen del grupo hidroxilo en la posición ___, el cual es imprescindible para la formación del __________________ con otro nucleótido.





    • Estrategia que nos permite determinar la secuencia completa a partir de varias reacciones.

    • El fragmento de DNA a secuenciar es fraccionado al azar mediante sonicación o digestión controlada con la endonucleasa DNAsa I

    • Obtención de deleciones secuenciales a partir de un extremo del fragmento que queremos secuenciar.

    • Este es el método más eficiente, ya que la información redundante que se obtiene es mínima.



    1. Deleción secuencial de fregmentos.

    2. Secuenciación mediante síntesis de varios iniciadores.

    3. Estrategias de secuenciación.

    4. Secuenciación de fragmentos al azar.
    Relaciona columnas.



  • Menciona si lo que se dice el verdadero o falso.

-El método de secuenciación mediante síntesis de varios iniciadores puede ser clonado entero en el vector……………………………………………………….( )

-En delecion secuencial de freagmentos los parámetros de la digestión deben ajustarse con objeto de obtener fragmentos delecionados que se diferencien en aproximadamente 200 nucleótidos………………………………………………( )

-El subclonaje mediante el uso de enzimas de restricción es un método que no requiere un conocimiento previo del mapa de restricción del DNA que se quiere secuenciar…………………………………………………………………………..( )

  • Organismos vivos manipulados genéticamente mediante la inserción de un gen que habitualmente no formaba parte de su repertorio genético ORGANISMOS TRANSGÉNICOS


  1. Se realiza reemplazando genes que no son esenciales para el virus por genes heterólogos.

  2. Producción mediante inseminación artificial.

  3. Conduce a la pérdida de función de un gen.

( ) Transformación genética mediante el uso de vectores retrovirales.
( ) Eliminación de genes.

( ) Transformación genética mediada por semen.

Relaciona las siguientes columnas:

  • Ratón desarrollado a partir de un huevo inyectado con el DNA transgénico.

  1. Ratón Mahogany.

  2. Ratón fundador.

  3. Ratón Hsiao.

  • Las siguientes son formas de realizar un ratón transgénico, EXCEPTO:

  1. Cell stem embrionarias inyectadas en huevos fertilazados.

  2. Inyectando el DNA en huevos fertilizados.

  3. Células stem embrionarias (ES cells) inyectadas en embriones.

  • ¿En qué día son aislados los embriones de las ratas?

  1. 4

  2. 5

  3. 2

  4. 3

  • Mediante que parámetro se identifica y selecciona al animal transgénico en la actualidad

  1. Analizando sus sentimientos

  2. Piel, características morfológicas, comportamiento

  3. Análisis de su ADN










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