Manual de prácticas de laboratorio




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4. PROCEDIMIENTO.
Técnica de los dos Portaobjetos.


  1. Colocar a una distancia de 1.5-1.9 cm del extremo derecho de un portaobjetos, una pequeña gota desangre ( del tamaño de 3 cabezas de alfiler) obtenida por punción capilar del talón, del lóbulo de la oreja ó por extracción venosa.

  2. Si se emplea sangre venosa mezclada con anticoagulante, el frotis deberá realizarse lo más pronto posible, debido a que el contacto prolongado con éste altera la morfología celular.

  3. Aproximar el portaobjetos extensor a la gora, dejando que hagan contacto y que por capilaridad éste se extienda a lo largo del borde.

  4. Se desliza el portaobjetos extensor hacia el extremo contrario, para lograr una película delgada de sangre.

  5. dejar secar y teñir.


ACTIVIDADES:

-Realizar 10 frotis correctamente confeccionados.
-Realizar esquema que muestra las partes de un frotis .

-Realizar esquema de tres frotis: demasiado grueso, demasiado delgado y correctamente realizado.

- Reporte de resultados.____________________________________________

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SERIE BLANCA: PRACTICA NO. 3

TINCIÓN DE WRIGHT Y REACTIVOS COMUNMENTE EMPLEADOS EN HEMATOLOGIA “


  1. INTRODUCCIÓN

La finalidad de la tinción de Wright es lograr que el alumno se sienta capacitado para preparar adecuadamente algunos de los reactivos y colorantes más comúnmente empleados en las áreas de hematología y microbiología, que como químico clínico tiene la obligación de conocer y dominar.



  1. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA .


COLORANTES.

A los colorantes de les puede clasificar en tres grupos:

1) Acidos. Son aquellos constituídos por sales cuya base es incolora y cuyo ácido es coloreado. A este grupo pertenecen las eosinas. Estas soluciones se usan para la coloración citoplasmática ó coloración de fondo.

2) Basicos. Son aquellas sales de ácido incoloro y base coloreada como el clorhidrato de azul de metileno. Estos colorantes tiñen por lo general algunos elementos del núcleo.

3) Neutros. Son aquellas sales con el ácido y la base coloreados, por ejemplo, los eosinatos de azul y azur de metileno , los más empleados en hematología. El método de Romanowsky, que emplea estos colorantes, ha sido la base de las coloraciones panópticas utilizadas en la actualidad ya que ha tenido un gran éxito en la tinción diferencial de la mayoría de las estructuras normales y anormales de la sangre. La mayor parte de estos colorantes policromos derivados del método de Romanowsky, se disuelven en alcohol metílico, combinando así, la fijación con la tinción. Los más conocidos de todos ellos, son los de Giemsa y de Wright.


Tipo de Error

Causas

Como se Corrige

Tinción demasiado azul

Tiempo excesivo de tinción

Lavado deficiente

Ph muy alcalino

Disminuir el tiempo de tinción

Lavar adecuadamente

Acidificar el pH

Tinción demasiado rosa

Tiempo insuficiente de tinción

Lavado excesivo

pH muy ácido

Aumentar el tiempo de tinción

Lavar adecuadamente

Elevar el pH

Precipitación de colorante

Colorante no filtrado

Secado de la laminilla durante la tinción.


Filtrado de colorante

Procurar que siempre haya un

buen menisco de colorante durante la tinción.


ANTICOAGULANTES.
Los 4 anticoagulantes más usados son: mezcla de oxalato amónico y de potasio ( ó simplemente oxalato amónico ), citrato trisódico, sequestrene ( EDTA ), y heparina.

Los 3 primeros impiden la coagulación sustrayendo el calcio del plasma sanguíneo por precipitación ó fijación en forma no ionizada. La heparina neutraliza la trombina y otras fases de la activación de los factores de coagulación.

El citrato trisódico, el EDTA y la heparina, pueden emplearse para impedir la coagulación de la sangre destinada a transfusiones, sin embargo, la mezcla de oxalatos, no, por ser tóxica.

Los oxalatos pueden usarse para determinaciones como hemoglobina, hematocrito y recuentos globulares, aunque para extensiones sanguíneas puede usarse tan sólo en los primeros minutos, pues más tarde pueden desarrollarse alteraciones de las células sanguíneas como formas dentadas de los hematíes, vacuolización en el citoplasma de los granulocitos, fagocitosis de los cristales de oxalato, artefactos en los núcleos de los linfocitos y monocitos, etc.Además no deben emplearse para determinaciones químicas de nitrógeno y potasio. Para investigaciones de coagulación, es muy útil el citrato trisódico.

El EDTA ó sequestrene es tal vez el anticoagulante más usado para el recuento de células sanguíneas. Se le compara con el oxalato para el estudio del hematocrito y hemoglobina, pero para estudios morfológicos, es todavía mejor, pues con él, no se forman alteraciones ni artefactos en las células sanguíneas, aún después de un buen tiempo de estar hecha la mezcla, si la sangre se refrigera ( 2 horas a 24 horas ).

La heparina también puede usarse para determinaciones como hematocrito y hemoglobina, pero no de óptimos resultados en las extensiones sanguíneas, ya que produce un fondo azul en aquéllas que son teñidas con el colorante de Wright.

  1. LISTA DE REQUERIMIENTOS



    1. Reactivos.

NUM.

NOMBRE DEL REACTIVO

CANTIDAD

1

Colorante de Wright

0.1 g

2

Metanol

60 ml

3

Na2HPO4

2.56 g

4

KH2PO4

6.66 g

5

EDTA

3g

6

Oxalato de amonio

0.8g

7

Agua destilada

1.5L




    1. Equipo de Laboratorio


Balanza Granataria

Balanza Analítica


    1. Materiales de Laboratorio


NUM

CANTIDAD

DESCRIPCIÓN

1

1

Mortero

2

2

Probetas de 100 ml

3

1

Matraz Volumétrico de 100 ml

4

4

Varillas de vidrio

5

1

Frasco de vidrio color ámbar de 1L de capacidad

6

3

Frascos de vidrio color ámbar de 150 ml de capacidad

7

1

Jeringa ó sistema vacutainer para toma de muestra

8

1

Ligadura

9

10

Portaobjetos

3.4 Preparación de los reactivos

3.4.1Colorante de Wright:

Colorante de Wright: 0.1 g

Metanol: 60 ml
Se tritura el colorante con el alcohol en un mortero; ésto se hace poco a poco. Esta operación debe durar 30 min. hasta completar disolución. Se deja reposar dos días y se filtra.


3.4.2 - Amortiguador ó Buffer de fosfatos
Na2HPO4 2.56 g

KH2PO4 6.66 g

Agua destilada para aforar a 1 L
Mezclar las sales con poca cantidad de agua destilada, e ir agregando poco a poco más agua, hasta aforar a 1 L. Guardar en un frasco ámbar de 1 L.

3.4.3- EDTA.

EDTA 3 g

Agua destilada 100 ml
Mezclar el EDTA poco a poco con el agua destilada.


3.4.4 -Solución de Oxalato de amonio.
Oxalato de amonio 0.8 g

Agua destilada 80 ml

Mezclar poco a poco el oxalato de amonio con el agua destilada.

En ambos, se utiliza 1 gota de solución por ml de sangre.

4.PROCEDIMIENTO.
4.1 Técnica: Tinción de Wright.
4.1.1. Seleccionar un portaobjetos nuevo de 25 X 75 mm para hacer extendidos, que tenga la orilla relativamente lisa.

4.1.2 Obtener una pequeña cantidad de muestra de sangre periférica.

4.1.3Colocar una pequeña gota de sangre a 2 ó 3 mm de la orilla de un portaobjetos limpio y seco. Colocar el portaobjetos para hacer extendido en un ángulo de 30 a 45 grados con respecto al portaobjetos que tiene la muestra y hacer contacto cn la gota. Esta debe extenderse rápidamente a lo largo de la orilla del portaobjetos para hacer los extendidos. Deslizar el portaobjetos de extensión sobre la superficie dispersando la muestra de sangre. El extendido de sangre debe medir aproximadamente 30 mm de largo . El portaobjetos de extensión no se despegará hasta haber extendido toda la sangre. El grueso del extendido de sangre puede regularse modificando el ángulo del portaobjetos de extensión, variando el tamaño de la gota de sangre, la presión ó la velocidad de extensión.

4.1.4 El extendido de sangre se seca con el aire. Una vez seco, se escribe con lápiz el nombre del paciente en una orilla del portaobjetos.

4.1.5 Fijar el extendido de sangre en alcohol metílico absoluto durante 2 a 3 minutos. El color del extendido de sangre cambiará de rojo a café claro. Esta fijación es recomendable aunque el colorante que se vaya a emplear se encuentre diluído en alcohol metílico absoluto.

4.1.6 Cubrir el portaobjetos completamente con el colorante. Después de 3 minutos añadir un volumen igual de amortiguador. Soplar ligeramente para mezclar uniformemente. Aparecerá un brillo metálico verde.

4.1.7 Después de 5 minutos enjuagar cuidadosamente con agua de la llave ó amortiguador de fosfatos, al principio con chorro delgado y suavemente y después con el chorro fuerte para eliminar todo exceso de colorante. Limpiar el reverso del portaobjetos en posición erecta. Cuando se haya secado, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos rectangular y fijarlo con una gota de líquido de montaje. Se puede usar sólo aceite de inmersión en una preparación temporal.
El alumno deberá ensayar tiempos hasta ajustar aquellos que más convengan para una óptima coloración. Así, con tres frotis más deberá ensayar: 2 minutos de colorante y 4 de amortiguador; 6 minutos de colorante y 6 minutos de amortiguador; 6 minutos de colorante y 11 minutos de amortiguador.

4.2 Resultados Esperados.

Los resultados esperados en la tinción serán los siguientes:
Hematíes en color rosa.

Núcleos de los leucocitos de azul púrpura, con la cromatina y paracromatina netamente diferenciadas.

Gránulos neutrófilos del citoplasma, lila ó violeta

Gránulos eosinófilos, rojo tirando a naranja.

Gránulos basófilos, púrpura tirando a azul oscuro.

Plaquetas, color lila oscuro.

Citoplasma de los linfocitos, azul claro.

Citoplasma de los monocitos, ligero azul.

Actividades:

-Practicar la tinción de Wright con frotis de sangre periférica.

-Corregir de acuerdo al recuadro , errores encontrados en la tinción.
- Reporte de resultados .______________________________________________________

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SERIE BLANCA:PRÁCTICA No. 4

EVALUACIÓN DE SANGRE PERIFÉRICA”
1.INTRODUCCIÓN.
Una vez que se ha hecho y teñido un frotis satisfactorio, éste puede ser evaluado en búsqueda de anormalidades. Cada examen debería incluir análisis con bajo poder ( 10X ), con alto poder ( 40 ó 45 X), e inmersión ( 100X ).Un error común consiste en comenzar el examen con el objetivo de inmersión.Ciertos problemas de la muestra y anormalidades morfológicas significativas pueden pasarse por alto a menos que todos los objetivos sean empleados.

La presencia de eritrocitos anormales en el frotis de sangre periférica a menudo brinda importantes claves en el diagnóstico diferencial de las anemias, y puede ser también de ayuda en el diagnóstico de otras enfermedades. La morfología de los eritrocitos puede verse alterada con cambios en el tamaño, en la forma, en las propiedades tintoriales de células individuales ó por la presencia de ciertos materiales dentro de ellas. Incluso, la presencia de solo una única célula con ciertos cambios, puede considerarse significativa; en otros, la anormalidad se considera importante sólo si un número significativo de células se ven afectadas.

Asimismo, en la serie blanca, es importante realizar el recuento diferencial, aún cuando los nuevos contadores electrónicos den un resultado anticipado del mismo, ya que sólo puede confirmarse éste por medio de dicha lectura. Del mismo modo, se buscarán anormalidades en las células blancas y éstas se reportarán, así como la presencia de células que normalmente no se ven en sangre periférica, sino únicamente en médula ósea, a menos que exista alguna patología presente.

Lo mismo aplica para las plaquetas, las células más pequeñas de sangre periférica.Se puede hacer un recuento indirecto de las mismas cuando así se requiera, y buscar anormalidades en su forma y en su tamaño. Algunas anormalidades pueden requerir que se indique le severidad del cambio. Todas estas determinaciones pueden diferir de observador a observador, conduciendo a una variación considerable en el análisis del mismo frotis de sangre.

Los laboratorios actualmente tratan de controlar estas inconsistencias desarrollando criterios para estandarizar la evaluación de la morfología. Así, muchos laboratorios usan un método semicuantitativo de evaluación, consistente en los términos: leve, moderado ó severo. O bien un sistema " por cruces" :1+, 2+, 3+, etc.

Tan importante como el que haya consistencia entre los observadores, es importante también la selección de una área apropiada del frotis para la evaluación. En un frotis en " cuña ", en el área "aplumada" ó terminal del frotis, demuestran cambios que pueden considerarse patológicos, p.e. macrocitosis, esferocitosis, células en "diana ", etc. En el área gruesa del frotis, las células pueden interpretarse como microcíticas en forma equivocada, y la morfología puede ser difícil de evaluar. También tenderán a formar apilamientos ( rouleaux ) en esta área. Por ello, el área ideal para examinar un frotis, es aquella que contiene aproximadamente 200-250 células por campo a seco fuerte. Esto corresponde a una área en donde los eritrocitos se tocan pero no se enciman. En el verdadero Roleaux, los márgenes individuales de las células son difíciles de distinguir y dan una imagen como de pilas de monedas que han sido empujadas y tiradas, imagen que persiste aún en las áreas más delgadas del frotis, aunque ahí exista menor cantidad de células. La intensidad de la formación de "rouleaux" depende de la concentración de las proteínas plasmáticas, especialmente el fibrinógeno. En enfermedades inflamatorias, los niveles de fibrinógeno pueden aumentar. También la elevación de gama globulinas, como se observa en el Mieloma múltiple, provoca formación de "rouleaux".
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