Manual de prácticas de laboratorio




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ACTIVIDADES.

- Reporte de resultados .______________________________________________________

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SERIE BLANCA: PRACTICA NO. 29

TINCIÓN CITOQUÍMICA PARA MIELOPEROXIDASA “
1.INTRODUCCIÓN
La citoquímica constituye en la práctica hematológica un complemento indispensable de la morfología óptica convencional.

Su finalidad es estudiar la presencia de ciertos componentes químicos (enzimas o sustancias diversas) en el interior de las células sanguíneas tanto hematopoyéticas como circulantes en sangre periférica.
A menudo resulta difícil diferenciar los blastos leucémicos de la leucemia linfoblástica aguda de los de la leucemia mieloblastica (M1), monoblástica aguda (M5A) y la leucemia megacarioblástica aguda (M7) utilizando solamente extensiones con las coloraciones de May-Grünwald-Giemsa.
Recientemente se ha propuesto estudiar las leucemias agudas basándose en tres niveles secuenciales de investigación que son: los métodos citoquímicos en primer lugar, el inmunofenotipo intracelular en segundo lugar y por último el inmunofenotipo de membrana.

Diversos procedimientos de tinción citoquímica contribuyen a llevar a cabo esta distinción. Cuando se utilizan las reacciones citoquímicas adecuadas junto con el aspecto morfológico de las extensiones con tinción de Wright-Giemsa, puede establecerse un diagnóstico preciso en la mayoría de los casos. Desde el punto de vista técnico todas las reacciones citoquímicas tienen en común 3 etapas fundamentales: fijación, incubación y contraste.

Estas tinciones pueden realizarse sobre sangre periférica, extensiones de medula ósea, preparaciones de nódulos linfáticos u otros tejidos.

2.PRINCIPIO Y METODOLOGÍA .
La mieloperoxidasa se sintetiza en el retículo endoplasmático rugoso, de donde pasa a las cisternas del aparato de Golgi quedando localizada fundamentalmente en la granulación prim aria o azurófila.

Dicha enzima se combina in vivo con peróxido de hidrógeno transformándose en un potente agente bactericida, viricida y fungicida. Así, muestra actividad en todos los estadios del desarrollo de los neutrófilos y se halla en los gránulos azurófilos. Los eosinófilos muestran una actividad intensa. Los linfocitos, basófilos y las formas eritroides no se tiñen.

La tinción citoquímica de mieloperoxidasa es fundamental en el diagnóstico diferencial de las leucemias agudas (positiva en las mieloblásticas y negativa en las linfoblásticas). La actividad peroxidasa puede faltar en algunos neutrófilos tóxicos de pacientes con infección y leucemia aguda, y en casos raros de deficiencia congénita de mieloperoxidasa.
La demostración citoquímica de esta enzima se basa en la acción oxidante de la peroxidasa sobre el substrato, bencidina, en presencia de peróxido de hidrógeno, apareciendo un precipitado amarillo ocre en el lugar del citoplasma en donde se ha producido la reacción.
3.LISTA DE REQUERIMIENTOS
3.1 Reactivos.


NUM

NOMBRE DEL REACTIVO

CONCENTRACIÓN

CANTIDAD

1

Formol

37%

10ml

2

Etanol absoluto




90ml

3

Dihidrocloruro de bencidina




0.3g

4

ZnSO4.7H2O

3.8%

1ml

5

Acetato de sodio3H20




1g

6

H202

3%

0.7ml

7

NaOH

1.0N

1.5ml

8

Safranina




0.2g


3.2 Equipo de Laboratorio

Balanza granataria

Balanza analítica
3.3 Material de Laboratorio



CANTIDAD

DESCRIPCIÓN

2

Vasos de precipitados de 100 ml

2

Matraces aforados de 100 ml

1

Pipeta graduada de 10 ml

2

Pipetas graduadas de 5 ml

1

Pipeta graduada de 1 ml

2

Frascos de 250 ml

10

Frotis de sangre periférica

3.4 Preparación de los Reactivos
3.4.1 Solución Fijadora

Formol al 37% 10 ml

Etanol absoluto 90 ml

3.4.2 Solución Colorante
Modo de Preparación:

Etanol al 30% ( v/v en agua ) 100 ml

Dihidrocloruro de bencidina 0.3 g

ZnSO4.7H2O al 3.8% 1 ml

Acetato de sodio 3H2O 1 g

H2O2 al 3% 0.7 ml

NaOH 1.0 N 1.5 ml

Safranina 0.2 g

Los reactivos se mezclan en el orden indicado. La bencidina a veces contiene un material insoluble. Al añadir el sulfato de zinc se forma un precipitado que se disuelve al añadir los demás reactivos. El pH de la solución debe ajustarse a 6.00 + 0.05. La solución se filtra y se guarda a temperatura ambiente; puede usarse de manera repetida por meses.
4.PROCEDIMIENTO.
4.1 Técnica:
4.1.1. Los frotis se fijan por un minuto con la solución formol etanol

4.1.2 Lavar con agua de la llave

4.1.3 Secar al aire PERFECTAMENTE

4.1.4 Sumergir en la solución colorante por 30 segundos.

4.1.5 Lavar con agua de la llave

4.1.6 Contrateñir por 30 segundos con solución acuosa de safranina al 1%

4.1.7 Lavar con agua de la llave

4.1.8 Secar al aire

4.1.9 Sellar con resina sintética y cubrir con cubreobjetos del #1
Actividades:

-Practicar la tinción citoquímica para Mieloperoxidasa con frotis de sangre periférica.
4.2 Resultados Esperados.
- Reporte de resultados .______________________________________________________

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SERIE BLANCA: PRACTICA NO. 30

ALFA NAFTIL ACETATO ESTERASA EN LEUCOCITOS “


  1. INTRODUCCIÓN.

Las esterasas son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar ésteres en sus componentes ácidos y alcoholes. Existen diferentes variedades según el substrato empleado.

Se utilizan 4 substratos: naftol-AS-C-cloroacetato, naftol-AS-D-acetato, α -naftil-acetato, α -naftil-butirato, los cuales al ser hidrolizados en presencia de una sal diazoica dan un precipitado insoluble en el lugar de la reacción.


  1. PRINCIPIO Y METODOLOGÍA .

Utilizando como substrato el naftol-AS-C-cloroacetato (CAE) se detecta una esterasa que es específica de la granulopoyesis neutrófila en la que es positiva a partir del mieloblasto y se expresa en forma de un precipitado rojo anaranjado muy brillante. Su utilidad diagnóstica se centra básicamente en el reconocimiento de células blásticas mieloides, si bien su aparición es más tardía que la de la mieloperoxidasa aunque iguala a ésta en especificidad.

Utilizando como substrato el naftol-AS-D-acetato, se obtiene una intensa positividad en la serie monocítica que, a diferencia de las restantes células hematopoyéticas, es fluoruro sensible. Dada su positividad más restrictiva es preferente usar el substrato α-naftil-acetato o α-naftil-butirato para marcar la serie monocítica y sus precursores, cuya positividad es intensa y se manifiesta en forma de un precipitado difuso por todo el citoplasma.

3.LISTA DE REQUERIMIENTOS.

3.1 Reactivos.


NUM

NOMBRE DEL REACTIVO

CONC.

CANTIDAD

1

Na2HPO4




20 mg

2

KH2PO4




100mg

3

Formaldehido

37%

25 ml

4

Acetona




45 ml

5

Na2HPO4




2.366

6

KH2PO4




2.267 g

7

Cloruro de Pararosanilina




250 mg

8

HCl

Concentrado

1.25 ml

9

Alfa Naphthyl acetato




50 mg

10

Etilén glicol monometil Eter




2.5 ml

11

Nitrito de sodio

4%

1.5 ml



3.2 Equipo de Laboratorio
Balanza granataria

Balanza analítica



    1. Materiales de Laboratorio




CANTIDAD

DESCRIPCIÓN

2

Vasos de precipitados de 100 ml

2

Vasos de precipitados de 500 ml

2

Probetas de 100 ml

2

Probetas de 500 ml

1

Matraz volumétrico de 50 ml

1

Tubo de 13X100 ml

3

Pipetas de 10 ml

4

Pipetas de 5 ml

2

Goteros de 10 ml

2

Goteros de 100 ml

2

Frascos de 500 ml

10

Frotis de sangre periférica




    1. Preparación de Reactivos


Soluciones de Fijación
3.4.1 Solución A
Na2HPO4 20 mg

KH2PO4 100 mg

Agua destilada 30 ml
3.4.2 Solución de fijación pH 6.6
Formaldehído al 37% 25 ml

Acetona 45 ml

Solución A ( #1 ) 30 ml

( Esta solución se guarda a 4°C )
3.4.3 Amortiguador de fosfatos 1/15 M pH 7.6


  1. Na2HPO4 2.366 g

H2O destilada 250 ml



  1. KH2PO4 2.267 g

H2O destilada 250 ml
Preparación del amortiguador:

Solucion a) 42.5 ml

Solución b) 7.5 ml
Soluciones de Tinción
3.4.4 Solución de Pararosanilina

Cloruro de Pararosanilina 250 mg

Agua destilada 5 ml

HCl concentrado 1.25 ml
Disolver calentando suavemente y agitando.

Dejar enfriar la solución y filtrar

( Esta solución se conserva a temperatura ambiente )
3.4.5 Solución de Alfa Naphthyl acetato
Alfa Naphthyl acetato 50 mg

Etilén glicol monometil Eter 2.5 ml
( Esta solución se prepara fresca , en cada ocasión ).
3.4.6 Solución de Pararosanilina hexazotizada
Solución de Pararosanilina 1.5 ml

Nitrito de sodio al 4% recién preparado 1.5 ml
( Esta solución se prepara fresca, en cada ocasión ).
3.4.7 Mezcla de incubación.
Buffer de Fosfatos 1/15 M, pH 7.6 45 ml

Solución de Pararosanilina hexazotizada 3 ml

Solución de Naphthyl acetato 2.5 ml

Ajustar el pH a 6.1+ 0.3 con NaOH 1N y filtrar

( Esta solución se prepara fresca , en cada )

4.PROCEDIMIENTO.
4.1 Técnica:
4.1.1. Fijar los frotis a 4°C por 30 segundos

4.1.2 Lavar los frotis con agua de la llave

4.1.3 Dejar secar a temperatura ambiente

4.1.4 Colocar los fotis en la mezcla de incubación a temperatura ambiente por 45 minutos en la oscuridad

4.1.5 Lavar con agua de la llave

4.1.6 Contrateñir con hematoxilina de Gill por 10 minutos

4.1.7 Lavar con agua de la llave

4.1.8 Secar a temperatura ambiente

4.1.9 Sellar con resina sintética y cubrir con cubreobjetos del #1
Actividades:

-Practicar la tinción citoquímica para Esterasas con frotis de sangre periférica.

- Reporte de resultados .______________________________________________________

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BIBLIOGRAFÍA
1 .BLOOD CELL MORPHOLOGY. Peripheral Smear Evaluation. Manual 1.Lynn Maedel and Sandra Sommer.American Society of Clinical Pathologysts.Chicago.
2.BLOOD CELL MORPHOLOGY. Benign or Reactive Changes in WBCs and Plateletes.Manual 3. Lynn Maedel and Sandra Sommer.American Society of Clinical Pathologysts.Chicago.
3.El Atlas de Hematología.Dr. Joaquín Carrillo Farga

4.Manual de Técnicas Básicas para el Laboratorio de Hematopatología.Instituto de Hematopatología AVL Society.
5.Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología.Segunda edición.Joan Lluis Vives.Josep Lluis Aguilar.Masson.
6.Citoquímica. http://web.udl.es/dept/medicina/citoweb/libro/pass/paginas/contenido/libro/citoquim.htm


Serie Blanca

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