La biotecnología en la conservación y uso de los recursos genéticos de papa introduccióN






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fecha de publicación03.08.2016
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LA BIOTECNOLOGÍA EN LA CONSERVACIÓN Y USO DE LOS RECURSOS GENÉTICOS DE PAPA



  1. INTRODUCCIÓN




La papa era conocida en América desde hace 10,500 años (Engel, citado por Montaldo, 1984.). Su domesticación y cultivo han ocurrido en fecha posterior. De Candolle en 1883 afirma que durante el período del descubrimiento de América, el cultivo de la papa era practicado, con todas las apariencias de ser muy antiguo, en las regiones templadas de Chile hasta la Nueva Granada (Montaldo, 1984).
El género de Solanum, según Hawkes, (1972, citado por Montaldo, 1984), es un de los más grandes del reino vegetal y su distribución es mundial, pero la concentración de la diversidad está en el continente americano, como ocurre con la familia Solanaceae.
Los recursos genéticos de la papa cultivadas necesitan la reproducción vegetativa para retener las combinaciones genéticas seleccionadas por los agricultores andinos y mantenidas como clones por muchos años. Si bien existen materiales diploides tanto silvestres como cultivados, su reproducción sexual hace que los logros por cruces sean perdidos rápidamente debido a la alta heterocigocidad de los materiales (Huamán, 1994).
Hasta hace unos años el CIP (CENTRO INTERNACIONAL DE LA PAPA) mantenía las colecciones de papa cultivada cada año por propagación clonal en el campo. Esto requiere un gran espacio de campo y es una actividad que exige mucha mano de obra, expone el material a la Infección por virus y no existe protección contra heladas, granizadas y patógenos. Como medida preventiva se almacenaban tubérculos de papa en cuartos fríos a 4°C, en tres diferentes localidades. Los riesgos de pérdida genética son muy grandes cuando la colección es cultivada en el campo. El CIP ha hecho grandes esfuerzos por transferir la colección de papa nativa cultivada a cultivo de tejidos ln Vitro, (Huamán, 1986).
Así como el cultivo de tejidos In Vitro, en la actualidad, las técnicas de biología molecular resultan cada vez más útiles para los especialistas y mejoradores de los recursos genéticos. Con la mayor sensibilidad de los métodos bioquímicos, se puede definir mejor la estructura genética de un genotipo en particular. Así el germoplasma puede ser más útil a los mejoradores mediante la identificación total de los caracteres de la colección.
Este documento trata sobre el empleo de técnicas de tejido de tejidos In Vitro y biología molecular, como herramientas de la biotecnología en el apoyo al desarrollo de la conservación, manejo, distribución y uso de los recursos genéticos en papa. En este sentido, los objetivos de esta revisión se apuntan a continuación.

  1. Objetivos


    1. Describir y discutir, mediante revisión de literatura, las técnicas In Vitro más usadas para la conservación y regeneración de germoplasma de papa.



    1. Hacer una relación sobre el uso de los marcadores moleculares en la conservación, caracterización y uso de los recursos genéticos en papa y especies relacionadas.



  1. EL CULTIVO DE TEJIDOS PARA LA CONSERVACIÓN E INTERCAMBIO DE GERMOPLASMA DE PAPA.



El cultivo de tejidos permite una rápida propagación clonal de un gran número de plántulas en un corto período y la conservación del germoplasma bajo condiciones controladas, requiriendo un reducido espacio para las labores. El estado de “libre de patógenos” de muchos cultivos In Vitro, facilita enormemente el Intercambio Internacional de germoplasma (Espinoza et al., 1989).



El CIP (Centro Internacional De La Papa), mantiene una colección con unos 5,000 clones, los cuales son una rica fuente de diversidad genética para el uso de los mejoradores en el cultivo de papa. El mantenimiento de esta colección en el campo es cara y la colección es susceptible a un amplio rango de riesgos tales como las enfermedades o condiciones climáticas adversas. El mantenimiento de la colección In Vitro permite una serie de ventajas sobre la siembra de la colección cada año en el campo:


  1. Reducción de los costos de labores.

  2. Evita las Infecciones en el campo.

  3. Evita los riesgos ambientales, como heladas y granizo.

  4. Disponibilidad de material para micropropagación

  5. Disponibilidad de material para la eliminación de patógenos.

  6. Disponibilidad de material para la propagación y la exportación todo el año.


Las técnicas In Vitro ofrecen el potencial para el mejoramiento de procedimientos en muchas áreas, Incluidas la transferencia, terapia , Indexación y la cuarentena de contenedores. En términos de riesgos, los cultivos In Vitro poseen ventajas importantes por cuanto el material en masa es transferido en forma reducida, no enmascara plagas y patógenos, como ocurre con el suelo y el material transferido es contenido en recipientes seguros aislados de fuentes de contaminación (IBPGR, 1988).
Cómo sea, es muy importante enfatizar que sin la apropiada terapia e Indexación, el cultivo In Vitro por si mismo, no determinan materiales libres de patógenos. El material en cultivo debe considerarse de menos riesgo que plantas provenientes de Invernaderos, el campo u otros orígenes menos controlados, pero más riesgoso que el material que ha pasado un proceso de cuarentena en una estación o bien está certificado de estar libre de patógenos (IBPGR, 1988).
El movimiento seguro de germoplasma de un país o continente a otro para propósitos de la conservación, evaluación y uso de los recursos genéticos, depende grandemente de la habilidad de asegurar que el material esté libre de plagas y patógenos. En muchos países es tomada una actitud conservadora al respecto de la Introducción de plantas. Este hecho ha impulsado severos impedimentos en el movimiento de materiales, particularmente aquellos vegetativos. Esta actitud conservadora, es justificada por la falta de adecuadas facilidades de cuarentena luego de su Ingreso, así como de un pobre conocimiento de la etiología y distribución de enfermedades y plagas relevantes (IBPGR, 1988).
En el caso de la papa, varias pruebas bioquímicas y moleculares están disponibles para la detección de virus y viroides. Estos Incluyen la hibridación de los ácidos nucleicos (Nucleic Acid Spot Hybridization, NASH), la prueba de aglutInación de latex (Latex AglutInation Test, LAT) y pruebas Inmulógicas como ELIZA (Enzyme LInked Immunosorbent Assay). Estas técnicas se apoyan en la Inoculación de Indicadores (particularmente para virus desconocidos) y una regular Inspección de vegetales a cargo de expertos. La erradicación de virus y viroides es llevada a cabo por medio de termoterapia (tratamientos de calor o frío) y el cultivo de meristemos apicales. En papa la distribución de germoplasma In Vitro se hace rutinariamente (IBPGR, 1988).
La distribución del germoplasma en cultivos In Vitro de papa está bien establecida y es rutinariamente practicado. Cultivos de vástagos (brotes) son Inoculados en pequeños tubos que contienen un medio semisólido. El material es cultivado por 2 o 3 semanas para Inducir enraizamiento y revelar cualquier contaminación por microbios. Para el tránsito, los tubos son empacados en cajas con poli estireno y despachada por correo aéreo. En 1984 el CIP despachó 2,500 tubos de cultivo a más de 30 países (Withers, 1988).

IV. CULTIVO DE MERISTEMAS



Actualmente, el CIP ha trasladado toda su colección de germoplasma de papa a condiciones In Vitro, las nuevas accesiones son rutinariamente Incluidas a este proceso (Espinoza et al., 1989).
El primer paso en el cultivo de meristemas es el aislamiento de los mismos. El punto de actividad de crecimiento de la planta es el meristema. Este es un pequeño órgano compuesto de células que se dividen rápidamente (células meristemáticas). Para la propagación de los cultivos de vástagos en papa, es ideal partir de material con las dos siguientes características (Espinoza et al., 1989):


  1. El meristema se desarrolla en cultivo en forma genéticamente estable (Espinoza et al., 1989). Este no es el caso del cultivo de callo, que es un conjunto de células desorganizadas y no diferenciadas con capacidad de división mitótica (Etienne, 1997). El cultivo de callo exhibe en muchas ocasiones irregularidades genéticas: reproducción vegetativa “no confome” (Espinoza et al., 1989). Las plantas regeneradas por medio del cultivo In Vitro de segmentos nodales deben resultar en progenies genéticamente idénticas, lo cual es muy importante para mantener la identidad de las variedades que se desean guardar como germoplasma (Mix, G.). Lo anterior es posible, porque se sabe que las células constituyentes de los tejidos de los vástagos (brotes), son genéticamente estables (Murashige, 1974). La variación somaclonal no es hasta el momento problema serio en papa, no hay suspensiones celulares y esto en apariencia no ha desarrollado problemas de inconformidad genética (Espinoza et al., 1989). La papa en todo caso es evaluada constantemente en campo para establecer su conformidad y calidad en términos genéticos en el CIP (Huamán, 1991).




  1. El aislamiento de meristemas reduce el nivel de infección viral en el tejido y bajo condiciones apropiadas puede ser utilizado para la erradicación completa de patógenos (Espinoza et al., 1989).


La papa como cultivo de propagación vegetativa, es propensa a la Infección acumulativa por bacterias, hongos, virus y viroides (Tovar, et al., 1985), así como riketsias y micoplasmas (Espinoza et al., 1989), proceso éste generalmente conocido como “degeneración”. Estas Infecciones pueden tener un efecto dramático sobre el rendimiento y la calidad comercial del cultivo, pudiendo afectar también la distribución Internacional del germoplasma de papa. Los tejidos meristemáticos están muchas veces libres de enfermedades. Es posible recuperar plantas Infectadas a su estado no Infectado, mediante el cultivo de meristemas y permitir el desarrollo de plantas sanas, a partir de estos cultivos (Tovar, et al., 1985; Lizárraga et al., 1989).
El principio general de la escasa presencia de virus y patógenos en el ápice de la planta, es que no existe procambium en el meristema y en consecuencia no hay medio de transporte para los patógenos hacia estas células (Flores, 1998). La alta concentración de auxinas en los meristemas parece restringir la activad de replicación de los virus (Espinoza, et al, 1989), a manera de enzimas de restricción. No obstante, partículas virales pueden alcanzar la región meristemática del ápice solamente por el movimiento de célula a célula (Espinoza et al., 1989) a través de los plasmodesmos (Lizárraga et al.,1989).
Estos atributos obviamente hacen del cultivo de meristemas y vástagos, materia ideal para la conservación a largo plazo de variedades (G, Mix, 1985).
El uso de termoterapia es también una herramienta para liberar de patógenos a los materiales susceptibles de cultivo como los meristemas. El CIP usa un procedimiento general que consiste en eliminar meristema apical principal antes de introducir a termoterapia a la planta completa. Las yemas axilares crecen mientras sufren un tratamiento de calor. Se brinda un régimen diario de temperatura de 36° C por 16 horas y 30° C por ocho horas y luz continua de alta intensidad (10,000 lux). Esto provee de una buena tasa de eliminación. Las plantas son mantenidas en estas condiciones por cuatro semanas. Los meristemas apicales y axilares son aislados y cultivados.
Con la termoterapia, se presume que se crea competencia por los sitios de síntesis de ácidos nucleicos y proteinas entre las muy rápidas células en división y las partículas virales, lo que puede conducir a un cambio en el balance entre síntesis y degradación de las partículas virales. Se supone también que las altas temperaturas debilitan las proteínas protectoras de algunos virus, exponiendo a éste último, temporalmente a enzimas de restricción, lo que también puede conducir a la inactivación del virus.
El domo del meristemo apical contiene verdaderas células meristemáticas, rodeado por primordios foliares y hojas primarias. El aislamiento de la porción apical, bajo condiciones asépticas y su posterior cultivo en un medio nutritivo también aséptico, conduce a un desarrollo de plántulas. La secuencia del desarrollo , en principio, sigue un patrón similar al del desarrollo normal de la planta. Las células del meristemo se dividen y la diferenciación de los tejidos continúa, las necesidades nutrimentales de la planta, es suplida por el medio, el cual es normalmente el basado en Murashige y Skoog (Espinoza et al., 1989).

La disección de los meristemos es delicada y requiere muchas horas de práctica Las plantas regeneradas por medio del cultivo In Vitro de segmentos nodales deben resultar en progenies genéticamente idénticas, lo cual es muy importante para mantener la identidad de las variedades que se desean guardar como germoplasma (Mix, 1985). Lo anterior es posible, porque se sabe que las células constituyentes de los tejidos de los vástagos (brotes), son genéticamente estables

(Espinoza et al., 1989).
Los meristemas aislados son colocados en un medio de cultivo Murashige & Skoog (MS). Estos meristemas son transferidos semanalmente a medio MS fresco. Medio de cultivo. Después de 6 a 8 semanas, las pequeñas plántulas son subcultivadas para mayor crecimiento y micropropagación en un proceso conocido como rejuvenilización, (Espinoza et al., 1989; Lizárraga et al., 1989).
Las plantas de papa obtenidas por cultivo de meristemas pueden ser examinadas para comprobar la presencia o ausencia de patógenos; Las plantas que se encuentren libres de patógenos conocidos, Ingresan luego a la colección que ha pasado la prueba de patógenos que normalmente es una indexación para virus, y cultivo para detectar básicamente nematodo dorado (Tovar, et al., 1985).
V. INDUCCIÓN Y UTILIZACIÓN DE TUBÉRCULOS In Vitro DE PAPA
Desde hace mucho tiempo los fitofisiólogos han tenido Interés en la fisiología del desarrollo y control hormonal de la tuberización de la papa. En estudios en plantas enteras y en esquejes de tallo con un solo nudo, se ha demostrado que es proceso de tuberización es extremadamente complejo. La Inducción In Vitro de tubérculos de papa en plantas que han pasado las pruebas de patógenos es de Interés no solo para las personas responsables de un programa de semilla de papa y de la distribución de germoplasma a nivel Internacional sino también para fisiólogos especializados en el estudio del desarrollo vegetal (Tovar, et al., 1985).
El control hormonal de la tuberización de la papa es un proceso de desarrollo muy complejo y existen muchas formas de alterar el balance hormonal de la planta e inducir así la tuberización, como la relación auxinas : citocininas (Hussey y Stacey, 1984). El CIP ha agregado a sus medios antigiberelinas como el cloruro de clorocolina (CCC). Estos métodos han dado como resultado la formación In Vitro de tubérculos (Tovar et al, 1985; Seabrook et al., 1993).
La técnica de la inducción de tubérculos incluye tres etapas bien definidas (ver también figura 1):



  1. Propagación mediante esquejes de tallo en un medio de agar. Que consiste en el uso de esquejes de plántulas almacenadas In Vitro transferidos a un medio MS con citocininas (Bencilaminopurina, BAP), giberelinas (ácido giberelico, GA) y auxinas (acido naftalacético, ANA) con 16 horas de iluminación (1000 lux) (Tovar, et al, 1985).




  1. Esquejes de tallo para medios líquidos. En un medio líquido de propagación se colocan tallos completos de plántulas In Vitro obtenidas en la etapa 1, sin raíces ni hojas en un agitador orbital, con 16 horas de iluminación (1000 lux) (Tovar, et al, 1985).




  1. Inducción de tubérculos. Se adiciona al medio de cultivo CCC y BAP así mismo como un incremento en la concentración de sacarosa. Se hace en condiciones de oscuridad a 22°. La tuberización se alcanza entre los 20 y 30 días (Tovar et al, 1985).


La producción de tubérculos (o microtubérculos –el término minitubérculos se reserva para aquellos que son producidos en invernadero a partir de vitroplantas o por tallos de esqueje adulto-), puede ser altamente influenciado por los genotipos y por el fotoperíodo en condiciones controladas (Seabrook et al., 1993). Estos mismos autores refieren que el peso de los microtubérculos para cultivares de diferentes duraciones en su ciclo es dependiente del fotoperíodo. Adicionalmente, las diferencias genotípicas, basadas en los grupos de madurez (ciclo vegetativo), durante la reacción de los cultivares a la longitud del día, son manifiestas. Por tanto, las condiciones de luz aplicadas a la multiplicación de cultivos de papa (etapa 1 y 2, Tovar et al., 1985) previas a los cultivos para inducción de tuberización, afectan los rendimientos de microtubérculos (Seabrook et al., 1993).
El principal potencial de la inducción de tubérculos In Vitro, es la posibilidad de procurar almacenamiento y distribución de germoplasma de papa, con fines de conservación del recurso genético, así como para los programas nacionales de mejoramiento en los diversos países. Una desventaja de esta tecnología es la posibilidad de perder el material cuando el transporte dura entre 18 y 22 días, ya que se transporta en condiciones de obscuridad, donde la mayoría de los materiales puede morir.
Si bien el uso de explantes de hojas (Seabrook et al., 1993) y la embriogénesis somática (Dodds, 1987) han sido empleados en los cultivos In Vitro de papa, lo más común hoy en día sigue siendo el cultivo de meristemos y los posteriores subcultivos de brotes para lograr micropropagación a ciertos niveles, al menos para la distribución y almacenamiento de germoplasma de papa y recientemente el uso de microtubérculos, sin que sea esta última una medida rutinaria.



  1. LOS MARCADORES MOLECULARES COMO HERRAMIENTAS PARA LA CARACTERIZACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS RECURSOS GENÉTICOS EN PAPA



Mientras las técnicas convencionales de mejoramiento en papa continúan incrementando la producción y el uso de la papa en el mundo, las de la de biología molecular, resultan cada vez, más útiles para los especialistas y mejoradores de los recursos genéticos (Watanabe y Dodds, 1991).
En este documento se tratarán las técnicas para marcadores moleculares de Isoenzimas, RFLPs (Restriction Fragment Length Polimorphism) y RAPDs (Random Amplified Polimorphic DNA), sin pretender por supuesto, hacer una relación monográfica de éstas, sino más bien su uso en papa, en particular en su aplicación al manejo de los recursos genéticos.


  1. ISOENZIMAS. Las isoenzimas, son variantes de una enzima en particular, perceptible generalmente en términos de tamaño molecular, forma y carga. Las isoenzimas o aloenzimas (enzimas codificadas para alelos específicos, son la expresión de un alelo en particular), son las proteínas más ampliamente usadas como marcadores moleculares (Phillips, 1995).


Las isoenzimas son variantes de una misma enzima, que comparten un sustrato común, pero difieren en su movilidad electroforética. El análisis se realiza extrayendo la enzima de los tejidos de la planta, tras lo cual, las variantes son separadas con electroforesis y visualizadas mediante la tinción del gel con colorantes específicos (Phillips, 1995).
El uso de isoenzimas en el género Solanum ha sido orientado para el estudio de híbridos interespecíficos. Giovannini et al. (1993), estudiaron mediante el uso de isoenzimas las relaciones existentes entre los genomas de diferentes especies de papa, combinados estos genomas en sus híbridos. Caracterizaron híbridos con marcadores de isoenzimas y RFLPs, distintivos para los genomas de las especies silvestres Solanum tarijense, Solanum demissum y Solanum chacoense, así como algunos individuos haploides (2n= 2x = 24), de Solanum tuberosum. Estos autores encontraron alta actividad enzimática en los híbridos, comparados con los padres, esto sugiere probablemente efecto de heterosis, debido al incremento de la actividad transcripcional en el nuevo esquema genético.
Ortiz et al. (1993), realizaron un análisis de QTL (Quantitative trait loci, Loci de características cuantitativas), en un estudio de papas poliploides polisómicas. Ordenaron poblaciones haploides en clases genotípicas (homocigóticas y heterocigóticas tanto en poblaciones dialélicas como trialélicas), a fin de determinar ligamiento de una locus para una isoenzima con un QTL. El grado de asociación entre el marcador isoenzima para el locus en particular y los QTLs, fueron determinados por la magnitud de la correlación lineal de la características cuantitativa y la frecuencia del alelo en cada individuo de la población haploide. Encontraron correlaciones significativas entre diferentes caracteres cuantitativos y la frecuencia del alelo de cada 10 loci para isoenzimas. Los resultados obtenidos apoyan el modelo de máxima heterocigosis, lo cual explica las pérdidas de vigor en haploides y por qué las perdidas de heterocigosis proveniente de un padre, resulta en rendimientos bajos de tubérculos.
Los análisis de correlación efectuados por Ortiz et al. (1993), indicaron que diferentes marcadores de isoenzimas estaban ligados a diferentes QTLs para la misma característica, en las poblaciones haploides. Esto indica que la importancia de QTLs específicos pueden cambiar en diferentes poblaciones de haploides.
En general, las isoenzimas pueden cumplir una buena tarea en servir como marcadores moleculares y ser empleados en el tratamiento de germoplasma de papa. Sin embargo, su uso está muy limitado por el escaso número de colorantes enzimáticos disponibles y por la imposibilidad de contar con suficientes marcadores para cubrir todo el genoma (Phillips et al.1995), esto es particularmente importante si lo que se desea es caracterizar los recursos genéticos, por lo que los marcadores de ADN son mejores opciónes.
Hasta 1991, el CIP, había aplicado la técnica de isoenzimas, basado especialmente en peroxidasas y estereasas. Mediante la aplicación de la técnica de electroforesis, el CIP redujo la colección de más de 15,000 accesiones a cerca de 5,000, representando aproximadamente a 3,500 diferentes genotipos (Huamán, 1991), debido a que logró determinar que mantenía muchos duplicados de muchas accesiones.


  1. Análisis con RFLPs (marcadores de ADN)


El análisis de RFLP es una técnica usada en los programas de investigación desde los años 70. Ha sido ampliamente usado en plantas para la caracterización de germoplasma, para la estimación de los niveles de variación en las colecciones de germoplasma, para estudios filogenéticos, monitoreo de pureza de semillas híbridas, para la selección de características agronómicas (mediante ligamiento) y otras aplicaciones específicas (Phillips et al. 1995).
El análisis de los RFLP, Fragmentos De Restricción De ADN De Longitud Polimórfica, consiste en cinco pasos (Philips et al. 1995; Klug y Cummings, 1999): 1. Digestión de las muestras de ADN con enzimas de restricción; 2. Separación de los fragmentos de digestión mediante electroforesis en geles de agarosa; 3. Transferencia de los fragmentos separados a una membrana de papel de nitrocelulosa o de nailon; 4. Hibridación con una sonda (“probe”) de ADN de una sola banda, con secuencia específica conocida y 5. Visualización o detección de las bandas de hibridación mediante el uso de métodos radioactivos o tinción química o de luminiscencia química. Los pasos 3 y 4, corresponden a la aplicación de la técnica de Southern blot (Klug y Cummings, 1999).

Lim et al. (1998), realizaron estudios sobre 22 cultivares de papa en Korea, entre variedades y lineas avanzadas de mejoramiento. Condujeron una serie de experimentos con marcadores moleculares, entre ellos el uso de RFLPs como marcadores para evaluar la diversidad genética entre estos cultivares. Los estudios incluyeron además experimentos con la amplificación de secuencias de ADN, mediante la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa), a partir de dos diferentes imprimadores dos (“primers”) de secuencia conocida, no es un análisis de RAPDs (Random Amplified Polimorfic DNA) ya que solo son dos imprimadores, en tanto que el análisis de RAPDs incluye una batería de 10 imprimadores.
Los autores del trabajo indican que el estudio se condujo con muestras de ADN genómico y organelar (cloroplastos y mitocondrias). El estudio reveló que las sondas (“probes”) para el ADN organelar no produjeron suficientes fragmentos de restricción en el análisis de RFLPs, y una banda monomórfica en las muestras de ADN del cloroplasto, lo que conduce a inferir que en general los 22 materiales evaluados no muestran variabilidad. En tanto que con el ADN genómico se obtuvo multiples bandas, polimorfismos (Lim et al. 1998). Luego de resumir el estudio en un dendrograma, en términos generales estos autores encontraron que las los cultivares de papa estudiados mostraron altos niveles de similaridad, como consecuencia de los bajos niveles de diversidad genética entre estos cultivares y las líneas avanzadas de mejoramiento (Lim et al. 1998).
Los recursos genéticos en papa son vastos, y muchas fuentes de caracteres deseables han sido identificadas en especies relacionadas. Un estudio de RFLP de 90 acceciones de Solanum, representando a 18 especies en las cuales, características útiles han sido identificadas, fue realizado por Bonierbale et al. (1991). La variación dentro de especies de los RFLP, correlacionó muy bien con los conceptos clásicos de diversidad genética basados en morfología, comportamiento en el mejoramiento y distribución geográfica.
En el CIP el uso de los RFLPs se ha incrementado desde 1989. Como se sabe la papa es tetraploide y tiene herencia tetraploide y tetrasómica. Debido que esa segregación es más complicada que la segregación diploide, la selección incluso de caracteres simplemente heredados es más costosa y difícil. Muchas metas de mejoramiento son caracteres cuantitativos cuya expresión está afectada por una fuerte interacción de genotipo / ambiente. Los marcadores genéticos no se encuentran suficientemente disponibles. Por lo tanto su uso en mejoramiento es relativamente limitado. Debido a lo complicado que puede resultar la técnica, los RFLP pueden ser modificados o sustituidos por los RAPDs (ADN Polimórfico Amplificado Al Azar) (Watanabe y Dodds, 1991).

  1. Análisis con RAPDs (marcadores de ADN).


El análisis de RAPDs (ADN Polimórfico Amplificado al Azar) se basa en el descubrimiento y aplicación de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Para una revisión amplia de PCR puede consultarse Ehrlich, (1989). Los polimorfismos producidos con la técnica de RAPD se denominan marcadores RAPD. Pueden resultar de cualquier cambio en la secuencia o sitio de unión del imprimador (“primer”), lo que implicaría la alteración de la secuencia de un pequeño segmento de ADN por el cambio en un nucleótido, esto es, una mutación puntual (Phillips et al. 1995). Esta pequeña modificación, impide que el imprimador se una a la cadena o también pueden ser el producto de cambios que alteren el tamaño o impidan la exitosa amplicficación del patrón de ADN. Como regla general, el tamaño de los variantes se detecta muy escasamente y los productos de amplificación individuales representan un alelo por locus. En los estudios de herencia, los productos de la amplificación por PCR, se comportan como marcadores dominantes (Phillips et al. 1995).
Phillips, (1995) indica que el análisis con RAPD requiere de cinco elementos básicos para llevarse acabo, los cuales salvo en lo que se refiere a los imprimadores, son los mismos elementos necesarios para la aplicación de la PCR:


  1. ADN patrón, es el ADN de doble cadena proveniente del organismo que se quiere analizar.

  2. Imprimador, Es un oligonuclótido, es decir, un segmento corto formado por una cadena simple de nucleótidos con la propiedad de localizar y unirse a sitios complementarios de ADN desnaturalizado. Los imprimadores más comúnmente usados en el análisis de RAPD poseen una longitud de 10 nucleótidos y deben tener un contenido de al menos un 50% DE Guanina/Citosina para funcionar correctamente, para la mayoría de las plantas los imprimadores pueden generar de 2 a productos de amplificación.

  3. Desoxinucleótidos, Se requieren concentraciones adecuadas de dATP, dGTP, dCTP y de dTTP, para la síntesis de la cadena de ADN.

  4. Solución “buffer”, las soluciones deben contener concentraciones óptimas de iones potasio y magenesio y ser calibrada generalmente a un pH de 8.4.

  5. Polimerasa (generalmente Taq), Esta es una enzima ADN-polimerasa termoestable extraída de una bacteria (Thermus aquaticus). Esta enzima tiene la propiedad de restituir la doble cadana de ADN mediante su síntesis a partir de un punto determinado fijado en este caso por el imprimador.


Al igual que para el PCR, durante el análisis de RAPD se dan una serie de reacciones químicas, repetidas en forma cíclica, cuya contribución relativa al proceso global varía entre los ciclos iniciales, medios y finales. El análisis de RAPDs se basa en que la probabilidad de que una secuencia dada de ADN (complementaria al imprimador), se encuentre en el genoma en cadenas opuestas del ADN. Como los imprimadores son de corta secuencia, 10 nucleótidos, la probabilidad de encontrar sitios complementarios es alta y obviamente aleatoria.
Los análisis con RAPDs, pueden servir para el estudio de genes útiles, hacer un seguimiento de genes en la introgresión, identificar y sintetizar los genes e integrar los genes sintetizados en fenotipos escogidos de papa mediante la transformación u otros métodos de transferencia de genes (Watanabe y Dodds, 1991).
Hasta el momento, el uso de RAPDs, se ha circunscrito al estudio y confirmación de diferencias entre tipos y progenies de híbridos, en particular híbridos somáticos. Takemori et al. (1994) realizaron un estudio para confirmar híbridos somáticos en el mejoramiento de poblaciones dihaploides de papa.
Si bien la producción de híbridos somáticos es accesible, en el ámbito del mejoramiento de dihaploides la confirmación de híbridos somáticos es difícil como resultado de la diversidad genética muy estrecha de los clones dihaploides. Estos autores encontraron que el análisis de RAPD es mejor que el de RFLP para la confirmación de hibridación, ya que el análisis de RAPD puede ser conducido por sistemas automatizados como el PCR y la búsqueda de polimorfismos entre los dihaploides parentales y la confirmación de híbridos pueden ser conducida muy rápidamente. Por otro lado, las cantidades de ADN que son necesarias para la ejecución de un análisis de RAPD son muy pequeña para la identificación de híbridos, comparado con RFLP que necesitan gran cantidad de ADN y en consecuencia mucho tejido vegetal.

Si bien los análisis de una variación en los PCR, es factible para el estudio de relaciones filogenéticas en papa, no ha sido ampliamente utilizado y se circunscribe en muchos casos al estudio de germoplasma poco variable en lugares donde la papa no es originaria como Japón y Korea (Lim et al. 1998).
El uso del ARN como marcador para establecer relaciones filogenéticas en papa ha sido también estudiado, pero poco desarrollado. En Alemania Borisjuk y Borisjuk (1994) estudiaron el ARN ribosomal y nuclear de especies de Solanum y otras especies de Solanaceas a fin de encontrar información sobre las relaciones evolucionarias entre especies del genero Solanum. Encontraron en general que las especies de Solanum de Europa son considerablemente más recientes que las especies americanas.

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