Fundamento de la tinción de gram para la observación y diferenciación de microorganismos




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fecha de publicación05.08.2016
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ESTRUCTURA DE UNA BACTERIA TIPO

La ultraestructura y la actividad fisiológica de las bacterias solo se puede apreciar con el microscopio electrónico en conjunción con las técnicas bioquímicas y citológicas adecuadas, como la ultracentrifugación, técnicas isotópicas de marcaje, utilización de medios de cultivo diferenciales, etc.
Los componentes estructurales básicos de las bacterias son:
* Pared bacteriana: Estructura presente en todas las bacterias. Es una envoltura rígida exterior a la membrana. Da forma a la bacteria y sobre todo soporta las fuertes presiones osmóticas de su interior. Los componentes fundamentales de la pared son los peptidoglucanos o mureínas, formados por anillos de polisacáridos complejos enlazados con oligopéptidos. Además contiene otros elementos diferentes según pertenezca al grupo de las Gram negativas o al de las Gram positivas:
En las Gram negativas hay una sola capa de péptidoglucanos sobre la que se dispone una membrana externa constituida por una capa de fosfolí pidos y otra de glicolípi dos asociados, estos últimos, a polisacáridos que se proyectan hacia el exterior.
En las bacterias Gram positivas la red de peptidoglucanos origina varias capas superpuestas, es gruesa y homogénea y no hay membrana externa.
NOTA: Algunos antibióticos actúan sobre los componentes moleculares de la pared; por ejemplo, la lisozima (presente en las lágrimas, moco nasal y en la mayoría de los tejidos y secreciones) que actúa rompiendo los enlaces glucosí dicos de los péptidoglucanos, lo que provoca la lisis por ósmosis de la bacteria; otros, como la penicilina, son antibióticos bacteriostáticos porque inhiben la síntesis de los péptidoglucanos y, por ello, interrumpen el crecimiento bacteriano.
FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN DE GRAM PARA LA OBSERVACIÓN Y DIFERENCIACIÓN DE MICROORGANISMOS.
INTRODUCCIÓN
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las células para la microscopía, son suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamados de tinción simple. Sin embargo, a menudo se utilizan métodos que no tiñen de igual modo todas las células, es el proceso denominado tinción diferencial. Uno muy usado en microbiología es la tinción Gram.
Basándose en su reacción a la tinción Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos: grampositivas y gramnegativas. Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía bacteriana ya que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias.
Para explicar el mecanismo de la tinción de gram se han propuesto varias hipótesis fundadas en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos.
TINCIÓN DE GRAM.
Método.
Extensión: En un porta bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca una gota de agua destilada a la que, con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequeña cantidad de suspensión de bacterias o, en su caso, de una colonia. Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensión por el calor, calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque
Coloración:

a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)

b) se lava con agua destilada

c) 1 minuto en lugol (mordiente: fijador del colorante)

d) se decolora con alcohol de 951 (decolorante)

e) se lava con agua destilada

f) 1 minuto en fucsina (colorante de contraste)

g) se lava con agua corriente

h) se seca suavemente y sin frotar con papel de filtro

Una vez que la preparación está totalmente seca, poner una gota muy pequeña de aceite de cedro y observar al

microscopio con el objetivo de inmersión.
Observación:

Las bacterias que aparecen coloreadas de violeta son Gram+ y las que aparecen coloreadas de rojo más o menos intenso, son Gram-.
* Cápsula bacteriana. En numerosas bacterias se forma en la parte externa de la pared una cápsula viscosa compuesta por sustancias glucídi cas. Esta envoltura, que se presenta en casi todas las bacterias patógenas, las protege de la desecación y de la fagocitosis por los leucocitos del hospedador, así como del ataquede los anticuerpos, lo que aumenta la virulencia de las bacterias encapsuladas.
La presencia de la cápsula no es, sin embargo, un carácter diferenciador, pues determinadas bacterias pueden o no formarla en función de los medios de cultivo.
* Membrana. Es una envoltura que rodea al citoplasma. Está constituida por una membrana de tipo unitario de 75 Å de espesor. Su estructura es idéntica a la de las células eucariotas, variando sólo en algunas de las moléculas que la componen; por ejemplo, en la membrana bacteriana no hay esteroides. Una particularidad que presenta la membrana bacteriana es la existencia de unos repliegues internos que reciben el nombre de mesosomas.

Las funciones de la membrana plasmática bacteriana son las mismas que en la célula eucariota, es decir, limitan la bacteria y regulan el paso de sustancias nutritivas.
Los mesosomas incrementan la superficie de la membrana plasmática y además tienen gran importancia en la fisiología bacteriana, puesto que en ellos hay gran cantidad de enzimas responsables de importantes funciones celulares, entre las que destacan las siguientes:


  • Transporte de los electrones, mediante el conjunto de transportadores de la cadena respiratoria, y fosforilación oxidativa.

  • Síntesis de diversos componentes de la membrana, la pared y la cápsula.

  • Contienen los pigmentos fotosintéticos y demás componentes de los fotosistemas.

  • La ADN polimerasa de los mesosomas regula el proceso de duplicación del ADN.


* Ribosomas. Son corpúsculos similares a los de las células eucarióticas, aunque de menor tamaño (su velocidad de sedimentación es de 70 S), compuestos por una subunidad pequeña de (30 S) y otra mayor de (50 S). Se encuentran dispersos en el protoplasma bacteriano, aislados o asociados en cadenas de ARNm (polirribosomas), y se encargan de la síntesis de proteínas.
* Cromosoma bacteriano. El ADN de la bacteria está constituido por una sola molécula en doble hélice (esta molécula es muy grande en comparación con el tamaño de la bacteria), circular, superenrollada y asociada a proteínas no histonas. Suele estar unida a los mesosomas. En las células bacterianas puede haber también una o varias moléculas de ADN circular extracromosómico de menor masa molecular que el cromosoma denominadas plásmidos. Estos plásmidos, en algunas bacterias, pueden tener genes que las protegen de los antibióticos o también genes que intervienen en los procesos de reproducción (plásmido F).
* Inclusiones. En el protoplasma bacteriano se encuentra una gran variedad de granulaciones, que cumplen, generalmente, la función de depósitos de sustancias de reserva.
* Flagelos. Son apéndices filiformes de mayor longitud que la bacteria que permiten su locomoción. Se presentan en número y disposición variable y están formados por fibrillas proteicas compuestas de una proteína llamada flagelina.
* Fimbrias o pili. Son filamentos huecos, delgados y rectos, situados en la superficie de determinadas bacterias y cuya función no está relacionada con la locomoción, sino con la adherencia a los substratos y el intercambio de fragmentos de ADN durante la conjugación.

ESTRUCTURA BACTERIANA
http://www.losmicrobios.com.ar/microbios/estructura%20bacteriana.html

Última actualización: Abril de 2009

INTRODUCCION

  • Las bacterias pertenecen al reino Procaryotae.

  • Son elementos unicelulares sin un nucleo verdadero.

  • Su tamaño aproximado es de 1-3 micras.


Estructura de una Bacteria

ELEMENTOS BACTERIANOS

A los elementos bacterianos los podemos dividir en:

Elementos obligados:

  • Pared bacteriana.

  • Membrana citoplasmatica.

  • Citoplasma.

  • Ribosomas.

  • Nucloide (Nucleoide) o cromosoma bacteriano.

Elementos facultativos:

  • Capsula.

  • Flagelos.

  • Fimbrias o pili.

  • Esporo.

  • Glicocalix.

  • Plasmidos.

  • Transposones.


PARED CELULAR


  • Se pone de manifiesto con la tinción de Gram:

    • Tinción desarrollada por Hans Christian Gram (1853-1938).

    • Permite dividir a las bacterias en dos grandes grupos:

      • Grampositivos y Gramnegativos

  • Es una estructura compleja y fundamental para la bacteria formada por peptidoglicanos (mureína o glucopeptido), cuyo componentes básicos son:

    • El N-acetilglucosamina (NAG)

    • El N-acetilmurámico (NAM).

    • Un tetrapeptido:

      • Compuesto por aminoácidos que se alternan en sus configuraciones L y D. De estos aminoacidos, el D-glutamato, D-alanina y el acido mesodiaminopimelico no se encuentran en otra proteína conocida.

  • El peptidoglicano representa el 5-20 % de la composicion de la pared de las bacterias Gramnegativas y el 90 % en las Grampositivas.



Componentes del Peptidoglicano


  • Su espesor varia según se trate de bacterias grampositivas o gramnegativas:

    • En las bacterias grampositivas es una capa sólida de 50-100 moléculas de peptidoglicanos

    • En las bacterias gramnegativas tiene un espesor de solo una o dos moléculas.

  • Por su rigidez le da su forma peculiar a la bacteria

  • La protege de los cambios de la presión osmótica del medio que la rodea.

  • Es el lugar donde se localizan numerosos determinantes antigénicos que permiten diferenciar a las bacterias entre si.

  • La endotoxina de algunos grupos también se encuentra aquí.

  • La pared celular se constituye (se "fabrica") mediante una serie de etapas enzimáticas en las que participan al menos 30 enzimas.

  • Es el sustrato donde actúan antimicrobianos como los beta-lactámicos.

  • Participa en la división celular.


Dibujo artístico de las diferentes morfologías bacterianas.
(Fuente: Museo Natura de San Diego)

MEMBRANA CITOPLASMÁTICA


  • Esta formada por fosfolípidos y proteínas, y a diferencia de las eucariotas, no contiene esteroles (excepto el mycoplasma).

  • Las enzimas del transporte electrónico se encuentran aquí (produce energía).

  • Componentes de la cápsula y la pared celular son sintetizados aquí.

  • Es una barrera osmótica, selectiva y activa:

    • Actúa como barrera osmótica para la célula.

    • Contiene sistemas de transporte para los solutos y regula el transporte de productos celulares hacia el exterior.

  • Las bacterias gramnegativas tienen dos membranas: una interna y otra externa, mientras que las grampositivas, solo poseen una membrana (interna).

  • Es sitio de acción de detergentes y antibióticos polipeptídicos como la polimixina (Por ejemplo: colistín).



CITOPLASMA
Formado 85 % por agua. Contiene los ribosomas y el cromosoma bacteriano.
RIBOSOMAS 
Compuestos por ARN ribosómico. Su importancia radica en ser el sitio de acción de numerosos antibióticos: Amino glucósidos, tetraciclinas, cloranfenicol, macrólidos y lincosamidas.
NUCLEOIDE O CROMOSOMA BACTERIANO
Llamado también equivalente nuclear. No posee membrana nuclear (de ahí el término nucleoide). Esta formado por un único filamento de ADN apelotonado (superenrollado). Confiere sus peculiaridades genéticas a la bacteria. Regula la síntesis proteica.
CÁPSULA
Estructura polisacárida de envoltura. Factor de virulencia de la bacteria. Protege a la bacteria de la fagocitosis y facilita la invasión. Permite la diferenciación en tipos serológicos.

FLAGELOS
Estructuras protéicas, de mayor longitud que los pili. Son de estructura helicoidal y locomotores (responsables de la motilidad bacteriana).   (Según la posición de los flagelos tenemos bacterias:   Monotricas: un flagelo en un extremo o ambos. Logotricas: varios flagelos en un extremo o ambos. Peritricas: flagelos en toda la superficie).


Bacteria y sus flagelos

FIMBRIAS O PILI 
Son estructuras cortas parecidas a pelos. Visibles solo al Microscopio Electrónico. Carentes de motilidad. Los poseen fundamentalmente las Gramnegativas. Intervienen en la adherencia de las bacterias al huésped. Facilitan el intercambio de ADN durante la conjugación bacteriana. Tiene capacidad antigénica.
ESPORAS
Estructura presente en algunas especies bacterianas exclusivamente bacilares. Le permite a la célula sobrevivir en condiciones extremadamente duras. El material genético de la célula se concentra y es rodeado por una capa protectora, que hace que la célula sea impermeable a la desecación, al calor y numerosos agentes químicos. Se coloca en una situación metabólica de inercia. Puede permanecer meses o años así. Cuando las condiciones son más favorables se produce la germinación, con la formación de una célula única que después se reproduce con normalidad. El esporo no se tiñe con los colorantes habituales y se identifica como una zona clara, redondeada u ovalada, que contrasta con el resto de la bacteria que aparece coloreada.
GLICOCALIX
Entramado de fibrillas polisacaridas situadas en posicion extracelular. Facilita la adherencia.
PLÁSMIDOS Y TRANSPOSONES
Los plásmidos (plasmidios) son elementos extracromosómicos compuestos por ADN de doble cadena, con frecuencia circular, autoreplicativos y autotransferibles que, a menudo, contienen genes que confieren a la bacteria resistencia a antibióticos.
Los transposones (genes saltarines o móviles) son elementos compuestos de ADN que pueden moverse de forma autosuficiente a diferentes partes del genoma bacteriano. No poseen la capacidad de autoreplicarse pero pueden transferirse a través de plásmidos. El transposón al cambiar de posición puede arrastrar una secuencia de ADN contigua y originar cambios fenotipicos en la bacteria.

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