Reacció n en cadena de la polimerasa




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títuloReacció n en cadena de la polimerasa
fecha de publicación22.01.2016
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Reacción en cadena de la polimerasa

PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es un método para analizar una corta secuencia de ADN (o ARN) incluso en las muestras que contienen sólo cantidades mínimas de ADN o ARN. La PCR se usa para reproducir (amplificación) secciones seleccionadas de ADN o ARN. Anteriormente, la amplificación del ADN implicando la clonación de los segmentos de interés en vectores para la expresión en bacterias, duraba semanas. Pero ahora, con la PCR realizada en tubos de ensayo, se tarda sólo unas horas. La PCR es altamente eficiente para que un número incalculable de copias se pueden hacer de la DNA. Por otra parte, la PCR utiliza las mismas moléculas que la naturaleza utiliza para copiar el ADN:

Dos "cebadores", corto de cadena simple secuencias de ADN que se sintetizan para corresponder al principio y final del tramo de ADN para ser copiada;

Una enzima llamada polimerasa que se mueve a lo largo del segmento de ADN, la lectura de su código y montaje de una copia, y

Una pila de bloques de construcción de ADN que la polimerasa necesita para hacer esa copia.

¿Cómo se ejecuta la PCR?

Como se ilustra en la imagen de la PCR, tres pasos principales involucrados en una PCR. Estos tres pasos se repiten durante 30 o 40 ciclos. Los ciclos se realiza en un termociclador automatizado, un dispositivo que rápidamente se calienta y se enfría los tubos de ensayo que contienen la mezcla de reacción. Cada paso - denatauration (alteración de la estructura), hibridación (unión), y la extensión - se lleva a cabo a una temperatura diferente:

La desnaturalización: a 94 ° C (201,2 F), el ADN de doble cadena se funde y se abre en dos piezas de ADN de cadena simple.

Hibridacion: A temperaturas medias, alrededor de 54 C (129,2 F), el par de cebadores de arriba (recocido), con la sola hebra "plantilla" (. La plantilla es la secuencia de ADN que será copiado) En la pequeña longitud de cadena doble ADN (la imprimación se unieron y plantilla), la polimerasa se adhiere y comienza a copiar la plantilla.

Elongacion: En 72 C (161,6 F), la polimerasa funciona mejor, y los bloques de construcción de ADN complementarios a la plantilla están acopladas a la imprimación, haciendo una molécula de ADN de doble hebra.

Con un ciclo, un solo segmento de molde de DNA de doble cadena se amplifica en dos piezas separadas de ADN de doble cadena. Estas dos piezas son entonces disponible para la amplificación en el siguiente ciclo. A medida que los ciclos se repiten, más y más copias se generan y el número de copias de la plantilla se incrementa exponencialmente.

pcr steps

En el PCR se da una amplificación exponencial

pcr copies

Termociclador

La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” Termociclador. Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/da/pcr_machine.jpg/220px-pcr_machine.jpg

Reactivos Necesarios para realizar una prueba por PCR

  • Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris. Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.

  • MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa-

  • dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.

-Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada uno.

  • Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1M-

  • DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.

El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.

  • Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.

Elementos que pueden servir para optimizar la PCR

  • Se usa DMSO, glicerol o BSA.

  • El ayudante más utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa

Procedimiento para extracción del DNA genómico (previamente realizado)

  • Se realiza un frotis bucal

  • El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0.9%

  • Centrifugar por 5 minutos a 7K

  • Descarta sobrenadante

  • Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10%

  • Incubar a 100˚C por 20 minutos

  • Centrifugar por 5 minutos a 7K

  • Tomar el sobrenadante ( DNA en solución)

  • Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella

Nota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.



Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)

Añadir los siguientes reactivos en el orden indicado:



Condiciones para reacción en el termociclador:

1 ciclo : 94°C por 2.5 minutos.

32 ciclos: 94 °C por 30 segundos

54 °C por 1 minutos

72 °C por 70 segundos

1 ciclo: 72 °C por 10 minutos

Llevar a reaccionar en el termociclador.

Secuenciación de DNA

Método enzimático de terminación de cadena (método dideoxi de Sanger)

  • Polimerización interrumpida de ADN

  • Se lleva a cado polimerización de ADN en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en diferente momento, obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.

  • Se examinan en electroforesis, se “lee” secuencia directamente del gel

Metodo Dideoxi de Sanger







Metodo De secuenciación automática

Electroferograma de la secuenciación automatica

Geles de secuencia (Automatica y manual)

dnagel gel

Analisis de la Muestra

  • La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.

  • Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.



  • La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción de plata, fluorescencia, radioactividad

pcr gel

Ladder: pesos conocidos

1: Fragmento a 1857 pb

2 y 4: Fragmento a 800 pb

3: No hay producto

5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

¿Cuál es el propósito de hacer una PCR (reacción en cadena de la polimerasa)?

Para hacer la PCR, el ADN original que se desea copiar no tiene que ser pura y abundante. Puede ser puro, sino que también puede ser una parte minutos de una mezcla de materiales. Por lo tanto, la PCR ha encontrado usos generalizados e innumerables - para el diagnóstico de enfermedades genéticas, lo toma de huellas dactilares de ADN, encontrar bacterias y los virus, la evolución de un estudio en humanos, clonar el ADN de una momia egipcia, establecer la paternidad o relaciones biológicas, etc. En consecuencia, la PCR se ha convertido en una herramienta esencial para los biólogos, los laboratorios forenses de ADN, y muchos otros laboratorios que estudian el material genético.

¿Cómo fue el descubrimiento del PCR (reacción en cadena de la polimerasa)?

PCR fue inventada por Kary Mullis. En el año 1983, Mullis trabajaba en Emeryville, California, por Cetus, una de las primeras empresas de biotecnología. Allí, él se encarga de hacer las cadenas cortas de ADN de otros científicos. Mullis ha escrito que él concibió de PCR durante la navegación a lo largo de la Pacific Coast Highway 128 una noche en su motocicleta. Él estaba jugando en su mente con una nueva forma de analizar los cambios (mutaciones) en el ADN cuando se dio cuenta de que había inventado en lugar de eso un método de amplificación de una región del ADN. Mullis ha dicho que antes de su viaje en motocicleta había terminado, que ya estaba saboreando las perspectivas de un Premio Nobel. Compartió el Premio Nobel de Química junto a Michael Smith en 1993

Tipos de PCR

PCR anidada


Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicón se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificación dentro del amplicón inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificación de un amplicón obtenido previamente, los cebadores sólo van a hibridar en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una única banda. Así, evitamos posibles hibridaciones inespecíficas de los cebadores. La desventaja de ésta técnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR in situ


La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica de PCR in situ se realiza una primera amplificación de ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequeñísimas de genoma. Esta tecnología es de gran alcance en la capacidad de amplificar específicamente una población de secuencias de menor representación.

PCR múltiplex


PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos o más pares de cebadores en un único tubo con el fin de amplificar simultáneamente múltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una única reacción todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultáneamente, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, menor cantidad de molde para el análisis, menor cantidad de reactivos, rápida construcción debase de datos.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)


Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sería:

  • 1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.

  • 2º paso: aplificación a partir de la primera hebra de ADNc.

  • 3er paso: PCR estándar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)


Artículo principal: PCR en tiempo real.

Reacción de PCR cuya principal característica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN específicas a partir de su temperatura de fusión (también denominado valor Tm, del inglés melting temperature).

Se puede dividir en las técnicas basadas en fluorocromos no específicos y en las técnicas basadas en sondas específicas.

En las técnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar sólo una secuencia por reacción pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realización. Es mucho más económica que la que usa sondas específicas.

Las técnicas basadas en sondas específicas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda está intacta, presenta una transferencia energética de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda está dañada y los dos fluorocromos están distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrón de fluorescencia y deducir el nivel de amplificación del gen.

La mayoría de estos inconvenientes se han solucionado con la introducción de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresión de la amplificación en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulación del ADN al final de un número predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificación usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fácilmente usando un sistema que realice la amplificación (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayoría pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificación y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.

Fuentes:

http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa

Mathews, C. K.; Van Holde, K.E et Ahern, K.G (2003). «6». Bioquímica (3 edición). pp. 204 y ss.ISBN 84-7892-053-2.

http://www.medicinenet.com/pcr_polymerase_chain_reaction/article.htm

http://es.wikipedia.org/wiki/Termociclador

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