Bibliografía IV. Objetivos del Estudio




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títuloBibliografía IV. Objetivos del Estudio
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fecha de publicación25.01.2016
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2.- Propagación de células Madre Humanas in Vitro.
En los roedores, células madre del SNC se encuentran en diferentes sitios del tejido nervioso (Palmer et al 1999), que incluyen áreas donde no hay neurogénesis detectable, tales como el nervio óptico y medula espinal. En el hombre, la localización de las células madre permanece en su mayoría desconocida. Las células madre fetales se han aislado de diversas áreas incluyendo la médula espinal (Vascovi y Cols 1999, Carpenter y Cols 1999), mientras que células madre en el cerebro adulto se han aislado del hipocampo, áreas sub ependimarias y neo corteza (Kukekov y Cols, 1999 y Levesque y Cols 2001). Las células madre continúan proliferando in Vitro en presencia de factores de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y factor de crecimiento de la epidermis. (EGF) (Svendsen y Cols 1997, Kukekov y Cols, 1999, Vescovi y Cols, 1999) o factor inhibidor de leucemia (LIF) (Carpenter y Cols 1999, Ficker y Cols 1999). Varios laboratorios han cultivado células madre humanas in Vitro, sin cambios aparentes en el crecimiento de las células y su potencial de diferenciación en periodos prolongados de observación (Carpenter y Cols 1999, Vescovi y Cols, 1999). Estamos conscientes que podrían ocurrir cambios genéticos en las células madre del SNC de humanos, que alteren el crecimiento y diferenciación celular, como se ha reportado en las células madre de roedores (Palmer y Cols 1997).
3.- Diferenciación de las células Madre del SNC en Neuronas Dopaminérgicas in Vitro
Una de las grandes ventajas de utilizar células madre para los transplantes, es que la diferenciación celular se puede programar y ajustar modificando las condiciones de crecimiento. Desafortunadamente es poco lo que se sabe de los mecanismos moleculares que median la diferenciación de las células madre en neuronas dopaminérgicas. Una proporción muy pequeña de células madre humanas se diferencia en neuronas dopaminérgicas (tirosina-hidroxilasa positivas ó TH +) después que se han retirado del cultivo los factores de crecimiento a inicia la diferenciación. Srandson y Cols (1997) reportan menos de 0.01% del total de neuronas se convierten en TH+ in Vitro. El tratamiento de las células madre con una combinación de IL-1b, IL-11 y GDNF (neurofactor de crecimiento derivado de células gliales) aumenta la velocidad de formación de neuronas en el cultivo de células (Carpenter y Cols, 1999).
Los estudios de Levesque y Cols han mostrado que el tratamiento de células madre del SNC humano crecen como “neuroesferas” en el cultivo y la adición de acido retinoico, dibutiril cAMP, FGF8 y GDNF resulta en diferenciación celular hacía neuronas dopaminérgicas. Sin tratamiento menos del 1% se diferencian en células TH+ y después del tratamiento 5-30% de las células fueron identificadas con TH+ (solicitud de patente en trámite).
Se conoce mejor el procedo de diferenciación de las células dopaminérgicas de las células madre del SNC en roedores. El desarrollo y la sobrevida de neuronas dopaminérgicas de la substancia nigra dependen de la expresión del receptor Nurr 1 de la hormona orphan nuclear en estas células. Una sobre expresión Nurr 1 en las células madre estimula la diferenciación dopaminérgica cuando las células se exponen a un medio acondicionado de glia (Wagner y Cols 1999).
Otros laboratorios han reportado el efecto del medio acondicionado de glia en la diferenciación de las neuronas dopaminérgicas (Daadi y Weiss, 1999). El análisis del desarrollo de neuronas mesencefálicas durante la embriogénesis ha mostrado que el FGF8 es esencial para el desarrollo de las neuronas dopaminérgicas (Ye et al, 1998). Desafortunadamente el tratamiento de las células madre con FGF8 (Factor de Crecimiento derivado de Fibroblastos) no aumenta el número de células TH+ en los cultivos. Fred Gage y Cols reportan la expansión de células precursoras en presencia de bFGF que resulta en aumento de diferenciación hacía neuronas dopaminérgicas. De esa forma los conglomerados de células en los cultivos de células del SNC humano contienen hasta 18% de neuronas dopaminérgicas.


4.- Trasplante de células Madre del SNC humano.

Experimentos de transplante de células madre progenitoras humanas, han mostrado una capacidad de mantenerse viables comparable a la del tejido fetal del embrión de rata (Vescovi y Cols, 1999, Fricker y Cols. 1999). Transplante de células madre del SNC no tratadas a un modelo experimental de rata con inyección de 6-OH DOPA, mostraron que solo un número pequeño de neuronas dopaminérgicas se desarrollan (Svendsen y Cols 1997). Las células transplantadas dieron la prueba de TH+ en menos del 0.01% y aún así el transplante disminuyó la conducta rotatoria inducida por 6-OH DOPA en 2 de sus animales, cuyos cerebros contenían neuronas TH+ en el estriado. Estos experimentos sugieren que las células madre del humano tienen la posibilidad de diferenciarse en neuronas dopaminérgicas dentro del estriado. Podríamos especular que el transplante de células madre indiferenciadas a los pacientes con EP podrían resultar en desarrollo de neuronas dopaminérgicas y reducción de los síntomas, sin embargo, el transplante de neuronas dopaminérgicas ya diferenciadas probablemente dé mejores resultados.
5.- Nuestros estudios preclínicos.
Los estudios preclínicos que hemos realizado han demostrado que el cerebro humano del adulto contiene células madre neuronales que pueden ser aisladas y multiplicadas y diferenciarse in Vitro en neuronas secretoras de dopamina. Estas neuronas productoras de dopamina sobreviven cuando son transplantadas al animal de laboratorio y al estriado del humano, lo que las hace un candidato ideal para ser utilizadas en el tratamiento y posible cura de la enfermedad de Parkinson (EP). A continuación haremos una descripción detallada de los estudios pre-clínicos que comprueban que, el uso de células madre neuronales, que se han diferenciado como neuronas dopaminérgicas, pueden ser útiles para el tratamiento de la EP.

5.1 Aislamiento y cultivo de células madre multipotenciales del SNC del adulto.
Hemos aislado células madre neuronales de cerebros de 16 pacientes adultos: en 2 se aislaron de biopsias de la corteza pre frontal, 12 del hipocampo y 2 de la zona peri ventricular. Un análisis más detallado se llevó a cabo comparando 3 de las muestras extraídas del adulto con células madre aisladas de un feto de 21 semanas.

Las células madre del SNC fueron tomadas del hipocampo de 3 pacientes con epilepsia sometidos a lobectomía temporal y de un feto de 21 semanas. Los especimenes fueron obtenidos de acuerdo con un protocolo (Comité Institucional de Revisión de Protocolos de Investigación (IRB) aprobados en el Centro Médico “Cedars-Sinai” de Los Ángeles Calif. (IRB protocolo #2475 y 2565). Las células madre aisladas del cerebro de adultos proliferaron in Vitro como “neuroesferas” (Fig. 1, A), expresando NESTIN Y MUSASHI-1 mRNA (figura 1 B) que son marcadores característicos de las células madre neurales (Lendahi y col. 1990, Sakakibara y cols, 1996). Las características de crecimiento de las células madre hipocampales y de la corteza del adulto fue similar con un tiempo para duplicarse de 4 días aproximadamente (figura 1 C). Las células crecen en presencia de factores de crecimiento básicos (FGF) Factor de Crecimiento derivado de células Epiteliales(EGF) y Factor Inhibidor de Leucemia (LIF) que son conocidos como factores de crecimiento para células madre neuronales. En promedio, la variabilidad en ritmo de crecimiento fue de menos del 15%.







Figura 1 A. Células madre aisladas del SNC del adulto proliferando como neuroesferas. B Expresión de nestin y musahi-1 mRNA. C. Curva de crecimiento de las células madre fetales y del adulto.


Figura 2. Marcador celular específico con Inmunohistoquímica, después de diferenciación de una célula madre del adulto. A Neurona beta-III tubulina positiva. B. Astrocito positivo para la proteína ácida fibrilar glial. C Oligodendrocito positivo a Galactocerebrosido.
Para examinar el desarrollo potencial de las células madre del SNC del adulto se analizaron las expresiones a marcadores celulares específicos beta III tubulina, la proteína acida fibrilar glial (GFAP) y el Galactocerebrosido (GalC) durante la diferenciación de neuroesferas fetales y del adulto. Cinco a treinta por ciento de las células diferenciadas fueron neuronas (beta II tubulina +) (Figura 2 A), 5 a 30% fueron astrocitos (GFAP+)(Figura 2B) y 1 a 5 % fueron Oligodendrocito (GalC+)(Figura 2 C).

No se pudieron identificar variaciones significativas en el desarrollo potencial de los clones de las células fetales y las del adulto. Sin embargo, la relación de la diferenciación en neuronas y células gliales varió notablemente para cada una de las células madre aisladas.

TABLA I
Células Madres Aisladas





F1

F2

AD1

AD2

AD3

Neuronas (β. III – tubulina +)

5 ± 2

23 ± 5

11 ± 2

30 ± 6

19 ± 5

Astrocitos (GFAP +)

50 ± 9

29 ± 5

46 ± 7

49 ± 8

20 ± 7

Oligodendrocitos (Galc C +)

5 ± 2

1 ± 1

1 ± 1

3 ± 2

1 ± 1



Tabla I. Cuantificación de la diferenciación de las células madre aisladas del feto (F1, F2) y del adulto (AD1, AD2, AD3) en el humano, después de su evolución espontanea en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los números representan la media del porciento y del error estándar.
Métodos: Aislamiento de células madre del SNC. El tejido cerebral resecado se colocó en DMEM/F-12 (Dubelco Modified Eagle Media f 12, GIBCO) congelado, conteniendo penicilina estreptomicina, para ser disecado mas tarde. El tejido se cortó en pequeños fragmentos embebidos con tripsina en solución 0.02 mg/ml en VERSEEN (GIBCO) a 37°C por 5 min. Después se agregó un inhibidor de la tripsina (Clonetics) mientras se trituraba el tejido mecánicamente. La suspensión de células se centrifugó a 400rpm por 5 minutos, la cápsula que contenía el tejido en solución se lavó con DMEM/F-12 y se esparció en una placa que tenía una densidad celular de alrededor de 5000-10 000 células viables por ml. En un medio compuesto de DMEM/F-12, suplemento B27 (GIBCO) y factores de crecimiento bFGF (20 ng/ml, Peprotec), EGF (20 ng/ml, Peprotec), LIF (20 ng/ml, Prepotec) y penicilina-estreptomicina (GIBCO). Las células madre crecieron como neuroesferas, mientras el medio se cambiaba cada 3 días. Las neuroesferas se disociaron por trituración mecánica cada 12 a 15 días. Todos los análisis ulteriores del tejido se hicieron con células madre que habían sido fragmentadas un número similar de veces. En los cultivos que son trasplantados a los pacientes con EP, el antibiótico debe ser retirado de la solución 30 días antes del trasplante.
Conteo de células: cada 5 días las neuroesferas son disociadas usando tripsina y las células separadas se cuentan a través de un hemocitómetro después de teñirlas con azul de tripan para identificar las células vivas.
Diferenciación de las células e inmuno histoquímica: La diferenciación de las neuroesferas se inicio esparciendo las células en laminas sobre placas colocadas en el medio de cultivo que contiene ácido trans-retinoico (RA, 10-6 M) y AMP dibutiril cíclico (dBcAMP, 1 mM). Las células se fijaron en formaldehído al 4% en PBS siete días antes de laminar el tejido sobre las placas para ser inmuno-teñido. Anticuerpo contra beta-tubulina tipo III (1:500, Sigma) se usó para detectar las neuronas, el suero anti GFAP (1:500, DAKO) para detectar los astrocitos y anti GalC (1:25, Rosche) para detectar los Oligodendrocitos. Los anticuerpos secundarios fueron suero de cabra anti-ratón FITC (1:200, Sigma) y rodamina de cabra anti-conejo (1:200, Boehringer). Las células inmuno-teñidas fueron contadas en 5 campos escogidos al azar en cada cultivo usando un objetivo x20. El número total de células se contó usando núcleos teñidos y DAPI (Pipetas Moleculares). Se sumaron las cuentas y se calcularon los porcentajes de células.
Conclusión: El SNC del adulto contiene células madre multipotenciales que continúan proliferando in Vitro en presencia de factores de crecimiento apropiados y se diferencian en neuronas, astrocitos y Oligodendrocitos. Los cultivos de éstas células como se ha descrito hacen posible multiplicar las células madre del SNC del adulto in Vitro, lo que es esencial para implementar las terapias basadas en remplazamiento celular.
5.2 Diferenciación dopaminérgica de las células madre in Vitro.
El bajo porcentaje de células dopaminérgicas que resultan de una diferenciación espontánea de células madre, obligaron a buscar condiciones de crecimiento que estimularan la diferenciación dopaminérgica in Vitro. Se ha demostrado que varios factores de crecimiento y reguladores de la transcripción celular están involucrados en la determinación del fenotipo dopaminérgico de las neuronas mesencefálicas. Después de numerosos ensayos con diferentes factores de crecimiento y agentes que se sabe estimulan la diferenciación neuronal, se encontró que el tratamiento de las neuroesferas disociadas con ácido trans-retinoico integro (RA) en concentración 10-6M + 1mM dibutiril AMP cíclico (dBcAMP), FGF8 (20 ng/ml) y GDNF (20 ng/ml) resulta en el desarrollo de un gran número de células TH+ y DDC+, que son células productoras de dopamina (Figura 3 y Tabla 2). El análisis de la producción y secreción de dopamina utilizando análisis de cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) también indica con precisión qué cultivos contienen el grado más alto de células TH+ y DDC+ y sintetizan y secretan dopamina.
La secreción de dopamina en estos experimentos se indujo con soluciones que contuvieran niveles altos de KCl. El análisis HPLC en fase inversa demostró la síntesis y secreción de dopamina. La concentración en el medio de cultivo de células diferenciadas 10 días después de iniciada la diferenciación varió de 0 a 100% (45 pg/ml promedio) en diferentes aislados de células madre. La estimulación de la secreción de dopamina agregando a los cultivos dopamina positivos a una solución 50 mM de KCl por 30 min, hace que se triplique la secreción de dopamina en el medio de cultivo (345 ± 74 pg/ml, n=3) los niveles de síntesis y secreción correlaciondon con la concentración de células TH+ y DDC+ en los cultivos de células madre (Tabla 2). Los cultivos con el las concentraciones máximas de células TH+ y DDC+ también contenían mas dopamina y tenían la mayor respuesta a la despolarización al KCl. Tanto las inmuno-tinciones como la secreción de dopamina demostraron la presencia de neuronas dopaminérgicas funcionales en los cultivos.
Después del tratamiento de células con RA, dBcAMP, FGF8 y GDNF, 10 a 40% de las células se diferenciaron como neuronas, como lo mostró la tinción con neurofilamento L y beta tubulina III. Hasta un 30% de esas neuronas resultaron TH+ y DDC+ y fueron consideradas como neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, existe una gran variación en el porcentaje de diferenciación dopaminérgica entre los diferentes cultivos de células madre, lo que indica claramente que la diferenciación dopaminérgica debe de ser evaluada durante las etapas tempranas de cada cultivo celular.







Figura 3. Diferenciación de células madre humanas in Vitro. A. Neuroesferas durante fase de expansión. B. Célula madre neural diferenciada a los 7 días de iniciada la diferenciación. C. Neurona positiva a la beta III tubulina mostrando fluorescencia. D. Neuronas diferenciadas TH+ a los 7 días de iniciada la diferenciación.

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