Bibliografía IV. Objetivos del Estudio




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TABLA II


Células

% neuronas

% TH+

% DDC +

Secreción de DOPA

pg/m

Dopamina

H1

35 ± 6

13 ± 3

12 ± 4

100 ± 40

350 ± 82

H2

11 ± 3

0.5 ± 0.02

0.5 ± 0.01

0

0

H3

25 ± 4

27 ± 3

22 ± 6

120 ± 39

370 ± 75

H4

14 ± 3

20 ± 4

18 ± 5

75 ± 31

210 ± 65

H5

25 ± 7

1 ± 0.1

1 ± 0.1

0

0

C1

39 ± 7

29 ± 7

32 ± 9

110 ± 26

340 ± 62


Tabla 2. Diferenciación dopaminérgica de células madre del SNC de adulto después de ser tratadas con 10-6M ácido trans-retinoico total(RA), dibutiril AMP cíclico al 1mM (dBcAMP), FGF8 (20 ng/ml), y GDNF ( 20 ng/ml) en condiciones basales y después de la respuesta funcional a la solución de KCl
Además de neuronas dopaminérgicas, los cultivos diferenciados contienen astrocitos, Oligodendrocitos y otros tipos de neuronas. También, en muchos casos se identificaron poblaciones celulares que no expresaron ningún tipo de diferenciación con los marcadores celulares, indicando que no eran neuronas, astrocitos u Oligodendrocitos y más bien permanecieron como células madre indiferenciadas. En diferentes cultivos se encontraron neuronas Gabaérgicas, colinérgicas, Glicinergicas y Glutamatérgicas. La tabla 3 resume nuestros estudios de diferenciación de las células madre.

TABLA III


Clon

% neuronas

% GFAP +

% GalC+

% GABA+

% CHAT+

% Glicina+

% Glutamato+

H1

35 ± 6

60 ± 3

2 ± 1

60 ± 8

1 ± 1

0

10 ± 3

H2

11 ± 3

55 ± 6

1 ± 1

90 ± 6

0

0

0

H3

25 ± 4

70 ± 7

5 ± 3

56 ± 8

2 ± 1

7 ± 3

2 ± 1

H4

14 ± 3

75 ± 5

1 ± 1

80 ± 7

1 ± 1

1 ± 1

1 ± 1

H5

25 ± 7

55 ± 5

5 ± 2

95 ± 7

0

0

0

C1

39 ± 7

60 ± 5

1 ± 1

50 ± 7

3 ± 3

5 ± 3

5 ± 2



Tabla 3. Desarrollo de astrocitos, Oligodendrocitos, neuronas Gabaérgicas, Colinérgicas, Glicinergicas y Glutamatérgicas que resultan de las células madre del SNC del adulto, después de tratamiento con la misma solución que la descrita en la tabla 2.

Métodos:
Las células del SNC del humano se incubaron para su crecimiento en un medio de suero F12/DMEM (GIBCO), al que se agregaron suplemento de crecimiento B27 (GIBCO), bFGF, EGF y LIF humano recombinado (todos de Pepro Tech, Inc.). Las células madre del SNC crecieron como neuroesferas en 25 cm2 o en matraces con cultivos Falcón de 75 cm2. El medio de cultivo se cambió cada segundo día y las neuroesferas se disociaron por trituración mecánica cada 12 – 15 días. Las células se esparcieron en placas cubiertas de tejido en medio libre de suero F12/DMEM (GIBCO), 10-6 M ácido trans retinoico, 1mM dibutiril AMP cíclico, FGF8 (20 ng/ml) y GDNF (20 ng/ml) incubados por 10 días. Antes de esparcir las células en las placas, fueron disociadas en pequeños cúmulos (50-200 células) por trituración mecánica en el medio de cultivo. La diferenciación celular fue evaluada por inmuno histoquímica usando anticuerpos contra tirosina hidroxilasa (TH) y DOPA decarboxilasa (DDC). Los cultivos de células se fijaron por 20 min. a temperatura ambiente con para formaldehído en solución salina buffer de fosfato (PBS) al 4%, lavado 3 veces en PBS, pH 7.4, permeabilizado usando una incubación de 10 min con TritonX-100 y lavado de nueva cuenta con PBS. Los cultivos fueron después incubados en suero de cabra en PBS al 3%, con Tween 20 al 0.1% por lo menos 1 hora a temperatura ambiente. El bloqueo fue seguido por incubación con anticuerpos primarios en suero de cabra al 1%+ Tween 20 por lo menos 3 horas a temperatura ambiente. Anticuerpo contra la beta-tubulina tipo III (1:100, Chemicon) se uso para detectar neuronas y anticuerpos contra tirosina hidroxilasa (1:100, Sigma) y DOPA decarboxilasa (1:200, Chemicol) que correspondían a neuronas dopaminérgicas. El anticuerpo contra la decarboxilasa del ácido amino gama butírico (GAD) fue utilizado para detectar las neuronas Gabaérgicas (1:1000, Chemicon), en tanto que anticuerpo anti glutamato para las neuronas Glutamatérgicas (1:100, Signature Inmunológicas) y anti glicina para las neuronas Glicinergicas(1:50, Signature Inmunológicos).Finalmente suero anti acetil colina transferasa (CHAT) para detectar las neuronas colinérgicas (1:100, Chemicon). Los cultivos fueron enjuagados en PBS por lo menos 3 veces e incubados con anticuerpos secundarios diluidos al 1% en suero de cabra y al 2% en Tween 20 por 1 hora a temperatura ambiente en penumbra. Los anticuerpos secundarios fueron suero de cabra anti ratón FITC (1:200, Sigma) y suero de cabra rodamina (1:200, Boehringer).

El análisis se hizo por cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC).
Se separó 1 ml. de medio de cultivo para los cultivos estimulados para producir secreción de dopamina, agregando solución 55mM de KCl-elusión con estándares de dopamina.
Conclusión:
Las células madre del SNC cultivadas en presencia de factores neurotrópicos y soluciones concentradas de KCl resultan en diferenciación de neuronas que sintetizan y secretan dopamina. El ritmo de diferenciación de las neuronas dopaminérgicas varia en diferentes cultivos de células madre entre el 0 al 30% del número de neuronas. Además otros tipos de neuronas que secretan glutamato, acetilcolina, GABA y glicina crecen en el mismo medio, así como astrocitos y Oligodendrocitos.

5.3 Trasplante de neuronas dopaminérgicas derivadas de células madre al estriado de ratas.
El mayor problema de los trasplantes de células dopaminérgicas provenientes de tejido fetal o de cualquier otro tipo de trasplante., es la sobrevida corta de las células transplantadas. Con las técnicas de trasplante actual solo sobreviven entre el 5 al 20% de las células transplantadas. En consecuencia, se necesitan 3 a 5 fetos para reunir entre 100 000 a 150 000 neuronas dopaminérgicas (Lindvall, 1997) para proporcionar solo 5 000 a 30 000 neuronas que sobrevivan. Usando neuronas dopaminérgicas derivadas de células madre es posible aumentar significativamente el número de neuronas transplantadas y optimizar el tiempo para el trasplante. El trasplante de células madre del SNC del adulto al estriado de la rata da como consecuencia el crecimiento y sobrevida de astrocitos solamente, mientras que el mismo trasplante en regiones neurogénicas como el hipocampo y la zona sub ventricular resulta en el desarrollo de neuronas de diferentes características de secreción (Fricker y cols 1999, Vescovi y cols 1999).
Hemos corroborado que células madre del SNC de humanos adultos en el estriado de las ratas sin un tratamiento químico para inducir diferenciación, dan como resultado el crecimiento solo de astrocitos y no de neuronas. En cambio, hemos transplantado células madre del SNC del hombre, después de que se ha establecido la diferenciación a neuronas dopaminérgicas al estriado de la rata encontrando sobrevivencia de neuronas tiroxina hidroxilasa positivas. La Tabla 4 resume nuestros resultados de sobrevivencia de neuronas TH+ en el estriado de las ratas 3 semanas y 2 meses después de transplantadas. Hemos determinado que el momento óptimo para el trasplante de neuronas dopaminérgicas es entre 2 y 4 días después de iniciada la diferenciación. Basados en esta observación hemos optado por trasplantar las células a los 3 días de diferenciación

TABLA IV





Clon

Número total de células

% de neuronas

% TH +


3 semanas

H3

3000 ± 50

28 ± 8

8 ± 4

H4

3000 ± 50

20 ± 5

3 ± 1

C1

3000 ± 100

50 ± 10

15 ± 6


















2 meses

H3

3000 ± 50

30 ± 7

15 ± 6

H4

3000 ± 50

15 ± 3

1 ± 1

C1

3000 ± 50

50 ± 9

25 ± 7



Tabla 4. Sobrevida de células madre del SNC del adulto, diferenciadas como neuronas células TH+ positivas 3 semanas y 2 meses después de transplantadas al estriado de las ratas. Las neuronas provienen de células madre que han sido tratadas para acelerar su diferenciación en neuronas dopaminérgicas de acuerdo a la técnica descrita en el texto. Las células madre provinieron de 3 muestras diferentes de tejido cerebral del adulto.

Usando anticuerpos anti núcleo celular humano pudimos también identificar la migración de las células humanas transplantadas al estriado de la rata. Más del 80% de las células transplantadas migran menos de 0.5 mm del sitio del trasplante a las 3 semanas y 2 meses de estudiadas. Sin embargo, algunas células de humano se identificaron a 5 mm del sitio del trasplante.
También se analizó la proliferación de las células humanas trasplantadas en el cerebro de la rata, utilizando como marcador la bromodeoxiuridina (BrdU). BrdU se inyectó intraperitoneal en las ratas transplantadas de 18 a 55 días después del trasplante (n=3 ratas). Los animales fueron sacrificados 21 días y 2 meses después del trasplante y 3 días después de la inyección de BrdU. El análisis inmuno histoquímico de la incorporación de BrdU en los cerebros no evidenciaron ninguna célula humana positiva al BrdU en el cerebro trasplantado. Basados en estos datos, concluimos que 3 semanas y 2 meses después de transplantadas, las células humanas no proliferan en el cerebro de la rata.
Métodos:
Células madre del SNC humano crecieron en un medio de suero F12/DMEM (GIBCO), con suplemento de crecimiento B27 (GIBCO), 20ng/ml de bFGF, LIF,y EGF humano recombinado. Las células madre del SNC crecieron como neuroesferas en 25 cm2 a 75 cm2 probetas de tejido de cultivo FALCON, cambiando el medio cada 2 días, las esferas se disociaron mediante trituración mecánica cada 12 a 15 días. Posteriormente las células fueron esparcidas sobre platillas cubiertas de poli-omithina para su cultivo en el mismo medio descrito y agregando ácido trans-retinoico en concentración 10-6, dibutiril AMP cíclico 1 mM, FGF8 (20ng/ml) y GDNF (20 ng/ml) incubados por 3 días. Antes de esparcir las células en el cultivo, son disociadas en pequeños conglomerados de 50 a 200 células, mediante trituración mecánica. Antes del transplante, las células fueron diferenciadas por 3 días y después se colectaron mediante una tripsinización leve (0.01 % de tripsina en Verseen, durante 5 minutos a temperatura ambiente, lavado en 2 ocasiones con F12/DMEM, colocadas nuevamente en suspensión en solución salina Dulbeco modificada y balanceada en fosfato (DPSB), lavado en 2 ocasiones con DPBS y re suspendidas en DPBS.
La cirugía estereotáxica se realizó en las ratas bajo anestesia con ketamina-xilasina. El sistema inmunológico de las ratas fue suprimido por inyección intramuscular de ciclosporina cada 3er día. Las ratas recibieron 3 micro litros de suspensión de células en el estriado de cada lado usando las siguientes coordenadas en relación al bregma: Anterior = + 0.6, Lateral = 2.8 y Ventral -4.8 a 4.2. La barra dental del estereotáxico se colocó a -2.3 y las coordenadas ventrales fueron consideradas a partir de la superficie de la dura madre. Alrededor de 100 000 células fueron introducidas a través de jeringas Hamilton. Los cerebros fueron extraídos y el estriado disecado y colocado en 4% para formaldehído durante toda la noche. Se tomaron secciones coronales y sagitales con un micrótomo con espesor de los cortes de 15 micras
Inmunohistoquímica:
Los cortes del encéfalo se trataron con BSA al 3% y Tween 20 al 0.02% durante 16 horas a 4 grados centígrados. Todos los anticuerpos primarios se diluyeron en PBS que contenía albúmina se suero bovino (BSA) al 3% y Tween 20 al 0.02%. Los anticuerpos utilizados en este estudio fueron anti núcleo humano, anticuerpo anti beta-tubulina tipo 2 y anticuerpo anti tirosina hidroxilasa. Para una doble tinción las secciones se incubaron simultáneamente con dos anticuerpos primarios y secundarios.
Conclusión: Nuestros datos demuestran que un gran porcentaje de neuronas TH+ sobreviven 3 semanas y 2 meses después del transplante de células a los 3 días de iniciada su diferenciación en Vitro. Se observaron variaciones entre diferentes cultivos de células madre, en la sobrevida de las células después de transplantadas, semejante a las variaciones observadas in Vitro en los experimentos de diferenciación celular. Los mecanismos moleculares y celulares que subyacen estas variaciones son desconocidos a la fecha.


5.4 Tumorogénesis de las Células Madre.
Las células madre del SNC proliferan activamente y sería concebible que formaran tumores después de transplantadas. Los datos provenientes de otros laboratorios indican sin embargo que las células madre del SNC no desarrollan tumores después de ser transplantadas (Vescovi et al, 1999). Hemos hecho pruebas para determinar la formación de tumores después de trasplantar células madre en la corteza y el estriado en dos modelos diferentes: ratas inmuno suprimidas y ratones sin pelo después de 5 meses de transplantados.
Métodos: Las células crecieron en medio libre de suero F12/DMEM, con suplemento de crecimiento B27y recombinante humano bFGF y EGF 20 ng/ml (Pepro Tech, Inc). Las células madre crecieron como neuroesferas, cambiándose el medio de incubación cada 3er día, disociando las esferas por trituración mecánica.
Cada 12 a 15 días. Doscientas mil células del medio de cultivo fueron extraídas e inyectadas estereotáxicamente en ratas anestesiadas y ratones si pelo, tanto en el hipocampo como en el estriado. Los animales se sacrificaron a los 5 meses y sus cerebros fueron estudiados para la formación de tumores en el sitio de inyección de las células diferenciadas. Ni el examen macroscópico de los sitios de inyección, ni el análisis histológico de secciones de 15 micras en el sitio del implante mostraron la formación de tumores.
Conclusión: Las células madre del adulto y las neuronas diferenciadas no son tumorogénicas.
6. Conclusión de los estudios preclínicos.
a. El SNC del humano adulto contiene células madre multipotenciales, que continúan su proliferación in Vitro en presencia de factores de crecimiento apropiados (bFGF, LIF y EGF) y se diferencian en neuronas, astrocitos y Oligodendrocitos.
b. El tratamiento de las células madre del SNC del humano adulto continua su proliferación y diferenciación en neuronas secretoras de dopamina en presencia de factores de crecimiento y soluciones trans RA integro, dibutiril AMP cíclico, FGF8 and GDNF.
c. Un alto porcentaje de neuronas diferenciadas dopaminérgicas sobrevive después de ser transplantadas al estriado de la rata.
d. Las células madre neuronales del humano adulto no son tumorogénicas.

BIBLIOGRAFÍA
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