Bibliografía IV. Objetivos del Estudio




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IV OBJETIVOS DEL ESTUDIO
A. Objetivo
El objetivo de este protocolo es demostrar la seguridad, efecto biológico y eficacia terapéutica del transplante autólogo de neuronas derivadas de células madre de la corteza cerebral en el tratamiento de la Enfermedad de Parkinson (EP). La hipótesis es que las neuronas derivadas de células madre neurales al ser adecuadamente diferenciadas y transplantadas producen mejoría clínica significativa y duradera.
B. Propósito del estudio
El estudio incluirá 48 pacientes diagnosticados con EP incapacitante. La duración del estudio se estima en 24 meses después del transplante. El estudio continuará si el objetivo primario se alcanza.
c. Nombre y tipo de células que se utilizarán.
Las células que se utilizarán en el protocolo “INVESTIGACIÓN CLÍNICA DEL TRANSPLANTE DE NEURONAS DOPAMINERGICAS DERIVADAS DE CÉLULAS MADRE NEURALES EN EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS I. ENFERMEDAD DE PARKINSON” tienen las siguientes características:
Neuronas Dopaminérgicas y Gabaérgicas diferenciadas
Estas células se utilizaran en el tratamiento de la EP. No tienen nombre comercial o patentado para estas categorías de células.

V. PROTOCOLO DE INVESTIGACIÓN.
A. Criterios de inclusión
Los pacientes serán seleccionados de acuerdo a los criterios del PROGRAMA DE ASESORIA PARA TRANSPLANTES INTRACEREBRALES (Core Assessment Program for Intracerebral Transplantation o CAPIT por sus siglas).
1. Criterio de diagnóstico clínico
El diagnóstico de EP se establecerá con al menos 2 de los siguientes síntomas

-temblor de reposo o postural

-rigidez muscular con signo de la rueda dentada

-bradicinecia

-alteración de los reflejos posturales

(Por lo menos un síntoma debe ser temblor o bradicinecia)
2. Respuesta al tratamiento con L-DOPA.
- La administración de L-DOPA debe mejorar por lo menos un 33% los síntomas de la enfermedad en alguna de las evaluaciones con escalas clínicas para EP (véase más adelante)
3. Escalas de evaluación clínica
-Estadio de Hoehn y Yahr II a IV bajo el efecto del medicamento (ON)

-Estadio III a V sin efecto del medicamento (OFF)
4. Historia de EP por lo menos de 5 años.
5. Una respuesta inicial satisfactoria a la L-DOPA, que se pierde progresivamente (fenómeno ON/OFF)
6.- Sin otras enfermedades neurológicas o enfermedades sistémicas graves.
7. La medicación antiparkinsónica debe mantenerse sin cambios por lo menos 3 meses antes de la inclusión del paciente en el protocolo.
8. Edad de 35 a 85 años

9. Aún los pacientes portadores de neuroestimuladores pueden ser candidatos.
10. El paciente y/o su representante legal deben de entender el procedimiento propuesto y firmar el consentimiento informado.
11. El paciente debe estar dispuesto y disponible para las consultas necesarias para su seguimiento de por lo menos 24 meses.

1 b. Criterios de exclusión

Parkinsonismo debido a trauma, tumores cerebrales, infección, enfermedad cerebro vascular, uso de fármacos, drogas, substancias químicas o tóxicas.
La presencia de parálisis oculomotora, signos cerebelosos, parálisis de cuerdas vocales, hipotensión ortostática (caída de más de 20 mmHg al ponerse de pie).
Signos piramidales, Amiotrofia.

Demencia severa.

Degeneración olivo-poto-cerebelosa.

Parálisis supra nuclear progresiva.

2b. Pacientes con hipertensión arterial severa, insuficiencia renal, hepática, cardiaca, cáncer u otra enfermedad grave.

3b. Pacientes que no estén disponibles para el seguimiento del estudio
4b Pacientes con estadios Hoehn y Yard < II o >de IV cuando estén bajo efecto de la medicación
5b Pacientes con fluctuaciones motoras por L-DOPA impredecibles.
6b Pacientes con cambios en medicación en los tres meses previos a la inclusión en el protocolo.
7b pacientes mayores de 85 años o menores de 35 años.
8b Pacientes con otras enfermedades del SNC.
9b. Pacientes que no firmen el consentimiento informado.


10b Pacientes con demencia significativa que les impida cooperar o llevar a cabo los requerimientos del estudio o comprender el contenido del consentimiento informado.
11 b. Pacientes con historia de alcoholismo o drogadicción.

3b. Criterios de Exclusión.
El estudio será suspendido en caso de que alguno de los siguientes eventos adversos se presenten y será reportado a la oficina de la COFEPRIS, FDA y al Comité de Ética del Hospital Ángeles del Pedregal:
Fiebre Post-operatoria inexplicable, Convulsiones, Hemorragia intracerebral, accidente vascular cerebral, infarto del miocardio, tromboembolia pulmonar, trombosis venosa profunda.
B. Procedimientos del Estudio
1. Inclusión del paciente
El (los) paciente (s) serán incluidos en el estudio sí las condiciones siguientes se cumplen:
El neurólogo obtiene una historia clínica completa del paciente y realiza un examen neurológico completo para excluir otros padecimientos neurológicos aparte de la EP.
El paciente satisface los criterios de inclusión y firma el consentimiento informado.
El paciente y el neurólogo completan la evaluación pre trasplante.
2. La evaluación pre trasplante (véase diagrama de flujo clínico)
El neurólogo llevará a cabo la evaluación pre-trasplante al 6º, 3er mes y 2 semanas antes de la fecha anticipada del trasplante. La medicación para la EP, a la cual el paciente es parcialmente refractario se mantendrá constante los tres meses previos al trasplante. La medicación no debe ser suspendida. Las siguientes pruebas recomendadas por el CAPIT (Lagaston JW y cols, Mov Disorders. 7:1-12,1992) se llevarán a cabo para la evaluación basal (pre tratamiento) y serán aplicadas por el neurólogo;
Escala Unificada de Evaluación de la Enfermedad de Parkinson (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale o UPDRS)

Escala de Hoehn y Yahr
Escala de Evaluación de Disquinesia
Evaluación en tiempos programados (Timed testing) (la mejor condición ON y la condición OFF efecto de la medicación).
Prueba de respuesta a la Levodopa.

Videograbación del paciente siguiendo el protocolo para video.

Prueba para la evaluación mental (“Mini-mental Status Test).
Actividades de la vida diaria.
Autoevaluación.
Las pruebas clinimétricas deben realizarse a la misma hora del día en todas las evaluaciones del estudio. Los pacientes serán instruidos en la medicación de la mañana de la evaluación.
La medicación y dosis, los datos demográficos y la información de condiciones pre-existentes también serán evaluadas en los exámenes pre trasplante.
C. Estudios de imagen.
Resonancia magnética (RM) de cráneo será utilizada para establecer la condición basal del paciente y descartar otras causas de Parkinsonismo.
Un estudio con fluoro-DOPA en Tomografía por Emisión de Positrones (Positrón Emission Tomography o PET), con obtención de imágenes después de la ingestión de 200 mg de Carbidopa, 12 horas después de suspender la L-DOPA que toma el paciente. Se obtendrán imágenes paramétricas para el análisis regional del Putamen y Núcleo Caudado, usando el cerebelo como un sitio libre de captación de la fluoro dopa en el plasma. Este estudio es opcional.

3. Obtención de células madre para transplante autólogo.
Los pacientes serán sometidos a una biopsia de su encéfalo para obtener células madre. Una biopsia estereotáxica del epéndima para ventricular del lóbulo temporal previa obtención de RM de cráneo se llevará a cabo bajo anestesia local. El lóbulo temporal seleccionado para tomar la biopsia será del hemisferio no dominante, para evitar riesgos de disfasia, disnomia y aún afasia. El epéndima peri ventricular puede ser abordado fácilmente a través de un abordaje ortogonal, a través de la región temporal anterior, que tiene poca vascularización cortical, evitando así riesgo de sangrado. El epéndima peri ventricular se encuentra en posición lateral y relativamente lejos del hipocampo, minimizando el riesgo de alteración de la memoria no verbal o eventos convulsivos.
Los pacientes esperarán de 3 a 4 meses después de la biopsia para recibir el trasplante de sus células después de la fase de proliferación y diferenciación para alcanzar un número aproximado de 20 millones de células para el transplante. La ventaja principal del transplante autólogo es la gran probabilidad de sobrevivencia de las células trasplantadas y su integración al tejido cerebral.
4. Procedimiento de Micro trasplantes.
Para el trasplante los pacientes serán operados en condiciones estereotáxicas bajo anestesia local. Las células serán implantadas en forma bilateral en el Putamen utilizando técnica estereotáxica guiada por imagen de RM y CT y correlacionándolas con la imagen de los estudios metabólicos de la PET.
El marco estereotáxico se fijará al cráneo bajo anestesia local y el Putamen y Núcleo Caudado serán visualizados por RM-CT. Posteriormente el paciente será colocado en la sala de operaciones y bajo anestesia local se realizarán trepanaciones bilaterales y a través de ellas se pasaran cánulas muy finas de jeringas de Hamilton dirigidas estereotáxicamente a los blancos pre determinados. Un total de 10 inyecciones (5 de cada lado) a 4 mm de distancia en el Putamen servirán para colocar la totalidad de las células a trasplantar. La razón de colocar los injertos a 4 mm de distancia entre sí, deriva del hecho de que las arborizaciones dendríticas de las neuronas dopaminérgicas fetales crecen varios milímetros, re inervando el estriado del huésped. Los puntos de entrada de las trayectorias de las agujas serán en sitios diferentes de la convexidad cortical. Los tractos al Putamen serán verticales con referencia al plano coronal. En cada blanco (target) estereotáxico se inyectará una suspensión de 50 micro litros, con un promedio de 2 millones de neuronas cada una (40 000 células por micro litro).inyectadas lentamente en un periodo de 10 min por inyección.
5. Evaluaciones durante el seguimiento.
El Paciente será hospitalizado en la unidad neuroquirúrgicos por un periodo anticipado de 24 horas. No se anticipan efectos adversos. Todos los pacientes recibirán antibióticos profilácticos el día de la cirugía.
Los seguimientos incluyen la aplicación de la escala UPDRS, un una bitácora de la medicación, ADL que serán repetidos en los meses 1, 3, 6, 9, 12 por el mismo neurólogo especialista en movimientos anormales (véase diagrama de flujo clínico). La medicación será temporalmente suspendida para evaluación basal pre quirúrgica.

Una RM de cráneo será realizada al día siguiente de la intervención y a los 6 meses. Los estudios de FDOPA-PET se repetirán a los 6 y 12 meses postoperatorios.
C. Mediciones de condición clínica.
Los métodos que serán usados para evaluar a los pacientes incluyen UPDRS, Mini mental Status Examination (Mini-Mental) por neurólogos especializados en movimientos anormales que tengan experiencia en la aplicación e interpretación de estas pruebas.
Las video grabaciones serán repetidas en cada visita de seguimiento para documentar el procedimiento. El propósito fundamental del video filmación es servir como documento permanente que evalúa la forma de recolección de los datos.
Herramientas para la Clinimetría
UPDRS (véase anexo) es una escala de evaluación clínica completa, internacional y validada para la mayor parte de los países (Estados Unidos Y México inclusive). La escala comprende 42 reactivos con un puntaje de 0 a 4 y evalúa el estado mental, las actividades de la vida diaria, la función motora, las complicaciones de la terapia médica (disquinesias, fluctuaciones ON-OFF y otras).
La escala de Hoehn y Yahr evalúa el estadio de avance de la enfermedad.
La escala de Schwab- England mide la condición funcional del paciente. Esta escala en particular evalúa el progreso de la enfermedad y la eficacia de cualquier tratamiento.
Escala de evaluación de las disquinesias (Dyskinesia rating scale).
La prueba de respuesta a la Levodopa.
Mini-Mental. Evalúa la condición neuropsicológica del paciente (MMSE, Folstein y cols, 1975). Es de uso común para determinar la condición cognitiva del paciente que incluye lenguaje, memoria, atención y praxias (véase anexos).
Evaluación por video filmación. Se hará de acuerdo al protocolo diseñado en Grenoble por Pollak y cols (véase anexo de video protocolo)
DATA FORM DESCRIPTION

Los investigadores deben documentar los resultados clínicos utilizando los formatos correspondientes contenidos en la carpeta de Forma para Reporte del Caso (CASE REPORT FORMAT O CRF) tanto en el periodo pre-trasplante, post-operatorio inmediato y el seguimiento Los formatos utilizados y la información recolectada es la siguiente:
a) Información confidencial del paciente.

b) Criterios de inclusión.

c) Evaluación pre-trasplante.

d) Medicación

e) Historia clínica ´pre-trasplante.

f) UPDRS (Unified Parkinson’s Disease Rating Scale)

g) Valoración neuropsicológica mediante Mini-Mental Status Examination

h) Valoraciones clínicas programadas a diferentes horas (Timed Testing)

i) Valoraciones clínicas durante el seguimiento

j) Examen motor para EP

k) Eventos adversos

l) Complicaciones

m) Terminación del estudio
Estos formatos están contenidos de el Anexo A
El seguimiento de los pacientes se hará a los 3, 6, 9 y 12 meses después de la operación. El seguimiento consistirá en repetir la aplicación de las escalas antes mencionadas y la recolección de eventos adversos y complicaciones. Se completará la recolección de datos con autoevaluación del paciente sobre sus actividades de la vida diaria y estado funcional. Las partes correspondientes a la calidad de vida y actividades de la vida diaria servirán como evidencia de los efectos benéficos de la terapia y de la mejoría funcional en la vida del paciente.
Las valoraciones se harán en tres ocasiones durante el periodo basal pre trasplante y a los 3, 6, 9 y 12 meses de seguimiento. Cada evaluación incluirá la UPDRS y Escalas motoras y serán llenadas por el neurólogo y el paciente.
Se determinará el perfil de seguridad y complicaciones de la terapia. Se documentarán las complicaciones y efectos colaterales tales como disfasia, trastornos de equilibrio, apraxias y otros listados en la sección se Análisis de Riesgos del protocolo. Los eventos adversos anticipados y no anticipados serán documentados, tanto los transoperatorios como los que ocurran en cualquier momento durante el seguimiento. Las condiciones pre-existentes que pudieran complicar el tratamiento también serán documentadas para integrar correctamente el perfil de riesgos de la terapia.
D. Métodos de Análisis Estadístico.
El estudio incluirá a 48 pacientes con EP o parkinsonismo y será realizado en un periodo de 2 años. Los pacientes serán voluntarios y admitidos hasta completar los 48 pacientes. Se estima que una muestra de 48 pacientes tendrá un 90% de poder para detectar diferencias usando una prueba t de “student” con un nivel de significancía de 0.05 en ambos sentidos. El análisis estadístico del nivel de discapacidad, UPDRS y actividades de la vida diaria (ADL) se hará para cada periodo de seguimiento en relación con la condición basal.

MANUAL DEL INVESTIGADOR
A. Resumen.
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por una pérdida importante de neuronas en la substancia negra del tallo cerebral. La pérdida de neuronas dopaminérgicas en la substancia negra da como consecuencia una degeneración del sistema dopaminérgico nigro estriatal que regula la función motora. A su vez, esto trae como consecuencia una disfunción motora que consiste en pobreza y lentitud de los movimientos voluntarios, temblor, congelamiento de la marcha, rigidez y postura en flexión. No hay cura para la EP. Numerosos intentos para remplazar las neuronas dopaminérgicas se han llevado a cabo colocando trasplantes en el cerebro con diferentes tipos de neuronas secretoras de dopamina, tales como tejido fetal humano rico en neuronas dopaminérgicas, trasplantes autólogos de médula suprarrenal, neuronas dopaminérgicas de otras especies, etc. Los resultados de estas terapias de remplazo celular, aunque prometedores, han mostrado una gran heterogeneidad de las células trasplantadas, riesgos de rechazo inmunológico y otros problemas relacionados al tejido trasplantado, además de crear preocupación social sobre las terapias de trasplante celular.
Recientemente, células madre del sistema nervioso central (SNC) se aislaron en mamíferos y se ha demostrado que pueden diferenciarse como neuronas dopaminérgicas o al menos como células secretoras de dopamina. Esto abre una perspectiva importante de poder utilizar células madre del SNC humano, diferenciadas in vitro como células dopaminérgicas, en una terapia de remplazo celular en la EP. Las células madre del SNC se pueden obtener tanto de fetos como de humanos adultos. La obtención de células madre del humano adulto hace posible diseñar trasplantes autólogos, que eliminan los riesgos de rechazo inmunológico y enfermedades trasmitidas por el material trasplantado.
Se propone el uso de células madre neurales obtenidas del mismo paciente, diferenciadas in vitro como células neuronales dopaminérgicas, para remplazar las células dopaminérgicas perdidas en el cerebro de pacientes con EP. Las células obtenidas del mismo paciente constituyen un trasplante autólogo y serán incubadas para su multiplicación in vitro en presencia de 3 factores de crecimiento: factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor inhibidor de leucemia (LIF).Antes de ser trasplantadas las células serán tratadas con el factor de crecimiento fibroblástico 8 (FGF8), factor neurotrópico derivado de la glía (GDNF), ácido trans-retinoico (RA) y dibutiril adenosin mono fosfato básico (dBcAMP). Este tratamiento resulta en iniciación de una diferenciación dopaminérgica de un número importante de células madre.

Tres días después de iniciada la diferenciación celular, las células serán micro trasplantadas al estriado del mismo paciente de donde fueron obtenidas. El tratamiento de las células resulta en una diferenciación de entre el 0-30% de las células hacia neuronas dopaminérgicas. Las células serán trasplantadas usando micro jeringas en 5 posiciones del Putamen, conteniendo 700 000 a 1000 000 de neuronas dopaminérgicas por paciente.
1. Antes de ser trasplantadas las neuronas se harán pruebas al cultivo para determinar:

-Una diferenciación apropiada (caracterización de las células, identidad y esterilidad del cultivo)
B. Procedimientos básicos de aislamiento de células madre, propagación (crecimiento y diferenciación.
Pequeños fragmentos de tejido cerebral se obtendrán a través de biopsias. La biopsia será estereotáxica del epéndima peri ventricular confirmada por RM del cráneo, ambas realizadas con anestesia local.
1. Aislamiento de células madre autólogas en el adulto.
El tejido cerebral que se obtiene en la biopsia será colocado en solución helada de DMEM/F-12 conteniendo penicilina y estreptomicina, para ser posteriormente disecado. El tejido será fragmentado en pequeños fragmentos de 0.5 a 1.0 mm³ y transferido a solución que contenga tripsina (0.02 mg/ml³ en Verseen, GIBCO) incubados a 37°C durante 5 min. Después de la incubación, una mescla inhibidora de la tripsina (Clonetics) se agregará y el tejido será triturado mecánicamente con una pipeta de Pasteur. La suspensión celular se centrifugara a 400 rpm por 5 min y la cápsula que la contiene se lavará con DMEM/F-12 y esparcido en áreas que contengan de 5000 a 10 000 células viables/ml en 6 cajas de cultivo y en un medio que contenga además de DMEM/F-12 (1:1), buffer Herpes, glucosa, bicarbonato de sodio, glutamina, suplemento B27(GIBCO), factores de crecimiento bFGF (20 ng/ml, Peprotec),EGF (20 ng/ml, Peprotec), LIF (20 ng/ml, Peprotec) y penicilina estreptomicina (GIBCO).
2. Multiplicación de células madre autólogas. Un medio libre de F12/DMEM(GIBCO) con suplemento de crecimiento B27, bFGF, (20 ng/ml, Peprotec), EGF (20 ng/ml, Peprotec), LIF (20 ng/ml, Peprotec) y penicilina/estreptomicina (GIBCO).
Las células madre crecen como neuroesferas en medios de cultivo Falcón de 25 a 75 cm³ y se cambia el medio de cultivo cada 3er día, disociando las esferas por trituración mecánica cada 12-15 días.

Cuenta de células: Cada 5 días las neuroesferas se disocian utilizando tripsina y las células se cuentan con un hemocitómetro después de teñirse con azul de Trypan, para identificar las células vivas.

3. Inducción de la diferenciación de las células madre a neuronas dopaminérgicas.
Las células madre del SNC se colocan en placas cubiertas con poly-omithine de 100 mm de diámetro, Falcón o Nunc) en suero libre de F12/DMEM, con suplemento B27, ácido trans retinoico integro a la 10-₆ M, dibutiril AMP cíclico 1 mM, FGF8 (20 ng/ml)y GDNF (20 ng/ml) e incubadas por 3 días. Antes de esparcir las células estas serán disociadas en pequeños agregados de 50 a 200 células mediante trituración mecánica en el medio de cultivo. Aproximadamente se esparcirán un número de células de 2 x 106 en 100 mm³ del contenedor del medio de cultivo y un total de 10 contenedores o placas. Después de 3 días se extraerán del cultivo las células diferenciadas mediante solución de tripsina (0.01% tripsina en Verseen por 5 minutos a temperatura ambiente). Los extractos serán lavados 2 veces en solución con F12/DMEM, re suspendidas en solución salina fosfato balanceada (D-PBS, GIBCO), lavado de nuevo con D-PBS y re suspendida en un volumen menor de D-PBS. Este tratamiento colectará entre 0.7 a 2 millones de células dopaminérgicas por cada contenedor y se enviarán 20 millones de células para ser trasplantadas en el quirófano.
C. Manejo del tejido cerebral obtenido durante la biopsia y las células para trasplante.

El tejido nervioso y las biopsias serán manejados de acuerdo a los siguientes procedimientos.
a) Obtención estéril.
Obtener el tejido directamente del cirujano anotando el nombre, fecha y hora de la biopsia, así como el sitio de donde fue obtenida la muestra. Se coloca el tejido biopsiado en un tubo con medio estéril que se etiqueta y se le asigna un número o código para su identificación ulterior. Se coloca el tubo en un contenedor con cierre y se llena la forma de la toma de biopsia.
b) Transportación de la muestra.

Se sumerge el espécimen en un contenedor con hielo seco que se lleva al laboratorio.
c) Manejo de las células.
El tejido de la biopsia será disociado y se iniciará el cultivo.

Cada uno de los especímenes se manejara por un solo individuo.

Los cultivos serán aislados en contenedores de Plexiglás con incubadoras que mantienen estable la concentración de CO2. Bajo la tapa del cultivo de tejido se manejarán las células de un solo paciente a la vez, esterilizando el contenedor antes de utilizarlo en el cultivo de células de otro paciente.
Se utilizan alícuotas de medio de cultivo agregando factores de crecimiento para las células de cada paciente.
Un tubo de ensaye conteniendo 20 millones de células se transportará a la sala de operaciones para ser implantadas dentro de las siguientes 24 horas, en un contenedor térmico a 37°C
D. Caracterización del producto.
El proceso de manufactura de las neuronas dopaminérgicas derivadas de las células madre autólogas y de éstas neuronas (producto final) antes de ser trasplantadas van a ser evaluadas para determinar su pureza, seguridad (no contaminación), identidad, potencia y estabilidad (véase diagrama de flujo).
1. Seguridad. El análisis de seguridad incluye esterilidad, contaminación con mico plasma, presencia de endotoxinas, ausencia de otros agentes contaminantes químicos o biológicos.
a) Esterilidad. Las pruebas de esterilidad se llevarán a cabo al 4° mes del cultivo, 20 días antes del trasplante y en el producto final (alícuota de células a trasplantar). Estas muestras serán enviadas al Laboratorio Charles River para ser analizadas según el procedimiento de “Pruebas de Esterilidad de Productos Biológicos” (Anexo E).
Además pruebas rápidas como tinción de Gram se llevarán a cabo inmediatamente antes de implantar las células en el quirófano.
b) Contaminación por mico plasma.
Pruebas específicas para determinar contaminación por mico plasma (tinciones de PCR y DAPI)serán utilizadas para analizar los cultivos cada mes por los 4 meses in vitro, 20 días antes de ser trasplantados y en el producto final que se envía al quirófano.

Pruebas para detectar la presencia de mico plasmas que se desarrollan en medios con agar y de aquellos que se no desarrollan en agar se llevarán a cabo en los cultivos a los 4 meses de incubación de las células madre. Estas pruebas también se realizarán en los Laboratorios de Charles River de acuerdo con su protocolo (Anexo F).
c) Endotoxinas
La presencia y la cantidad de endotoxinas en las muestras serán analizadas usando el ensayo Limulus Amoebocyte Lysate del laboratorio Charles River de acuerdo a su protocolo (Apéndice G)
La presencia de endotoxinas se llevará a cabo en las células para trasplante20 días antes del trasplante.
d) Ausencia de otros agentes contaminantes.
Los estudios de laboratorio de los pacientes incluyen pruebas virales para VIH, Hepatitis A, B, C y citomegalovirus (CMV), utilizando el laboratorio clínico del Centro Médico “Cedars-Sinai” (ELISA ).
La contaminación potencial de células madre autólogas por HIV, Hepatitis, CMV, HTLV1 y virus Epstein Barr se analizará a los 4 meses del cultivo, 20 días antes del trasplante y en el momento del trasplante usando tinciones PCR.
2. Identidad y Pureza
El único tipo celular que ha demostrado efectividad en la enfermedad de Parkinson es el trasplante de células dopaminérgicas. La diferenciación dopaminérgica y la identificación de la presencia de otros tipos de células en los cultivos se llevarán a cabo durante el proceso de diferenciación y antes del trasplante, para garantizar el efecto terapéutico de las células trasplantadas.. Solo cultivos que tengan un mínimo de 15% de células dopaminérgicas serán utilizados para trasplantarlos. Antes de trasplantarlas, las células serán lavadas por lo menos 3 veces con PBS para reducir el nivel de factores de crecimiento presentes en el medio de cultivo a niveles muy por abajo del útil. El triple lavado usando PBS (100x excess PBS) reduce la concentración de factores de crecimiento 104 veces, lo que muy inferior al valor kd de los receptores de factores de crecimiento.
a) Análisis de la diferenciación de las células madre.
Se comprueba la diferenciación de las células madre de la siguiente manera:
Cuatro meses después de iniciado el cultivo de las células, cuando el número de células es entre 50 000 a 100 000.
Veinte días antes del trasplante.
Una alícuota de las células que se van a trasplantar se prueba para determinar su diferenciación dopaminérgica y la diferenciación y presencia de otros tipos de células.

Todas las pruebas evaluarán las siguientes características:

  • Análisis inmunohistoquímico de células TH positivas (células dopaminérgicas)

  • Análisis inmunohistoquímico de células DDC positivas (neuronas dopaminérgicas).

  • Análisis inmunohistoquímico de células tubulina β III positiva (neuronas).

  • Análisis Inmunohistoquímico de células positivas al GFAP (astrocitos).

  • Análisis inmunohistoquímico de células GalC positivas (0ligodendrocitos).

  • Análisis inmunohistoquímico de células GAD positivas (neuronas Gabaérgicas).

  • Análisis inmunohistoquímico de células CHAT positivas (neuronas colinérgicas).

  • Análisis inmunohistoquímico de células positivas a la glicina (neuronas Glicinergicas).

  • Análisis inmunohistoquímico de células positivas al glutamato (neuronas Glutamatérgicas).


Cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC) para la presencia de estimulación de la secreción de dopamina.
Métodos de Inmunohistoquímica:
Las células del SNC humano crecerán en un medio F12/DMEM, implementadas con suplemento para el crecimiento B27, recombinantes humanos de bFGF, EGF y LIF en concentración de 20 ng/ml. El medio de cultivo será cambiado cada 3er día, las neuroesferas de células serán disociadas por trituración mecánica cada 12 a 15 días. Las células serán extendidas sobre platos de cultivo cubiertos de poli-omithina en un medio F12/DMEM con suplemento para crecimiento B27, ácido, trans-retinoico, dibutiril AMP cíclico 1 mM, FGF8 y GDNF en concentraciones de 20 ng/ml en cultivo durante 10 días. Las células serán separadas por trituración mecánica en congregados de 50 a 200 células estando inmersas en el medio de cultivo. Las alícuotas de los cultivos de células se fijarán en para formaldehido en PBS, durante 20 min a temperatura ambiente, después lavadas 3 veces en PBS con pH de 7.4, permeabilizadas incubándolas en Tritox X-100 al 0.1% durante 10 minutos y lavadas nuevamente con PBS. Los cultivos serán incubados en suero de cabra al 3% en PBS agregado de Tween 20 a temperatura ambiente durante una hora El bloqueo será seguido de incubación con anticuerpos primarios en suero de cabra al 1%, agregando Tween 20 a temperatura ambiente por más de 3 horas. La diferenciación será evaluada por tinciones de Inmunohistoquímica usando anticuerpos anti:
DOPA decarboxilasa.

β tubulina Tipo III.

GFAP

GalC

Gama aminoácido decarboxilasa

L-glutamato.

Glicina

Acetil colina transferasa.
Después de la Incubación con los primeros anticuerpos los cultivos se lavarán con PBS en 3 ocasiones y se incubarán con anticuerpos secundarios diluidos en suero de cabra al 1.0% con 0.2% de Tween 20 durante una hora a temperatura ambiente y en penumbra. Los anticuerpos secundarios serán suero de cabra anti-ratón FITC (1:200) y suero de cabra anti ratón rodamina.
3. Potencia.
La presencia de marcadores dopaminérgicos en las células diferenciadas no garantiza la función de las células como productoras de dopamina, la función dopaminérgica será comprobada mediante el análisis con cromatografía de líquidos de alta presión (HPLC) sobre las células diferenciadas y sobre el medio de cultivo después de inducir la secreción de dopamina mediante una despolarización de la membrana. Solamente las células que muestren ser secretoras de dopamina por estas técnicas serán utilizadas para trasplantarlas.
HPLC para comprobar la producción y secreción de dopamina por las células:
Se tomará 1ml de medio de cultivo de las células cultivadas al que se agregará KCl en solución 55 mM por 30 minutos para estimular la secreción de dopamina. La dopamina será estabilizada inmediatamente agregando al medio de cultivo 88μl de ácido orto fosfórico i 4.4 mg de meta bisulfito. Las muestras serán enviadas para HPLC al laboratorio especializado para su análisis. La dopamina será extraída de las muestras utilizando el método de extracción de aluminio y con un análisis de fase reversa de una columna de C18 y MD-TD móvil. Los resultados serán validados por coelusión con estándares de dopamina.
4. Estabilidad.
El crecimiento in vitro de las células madre podría cambiar el potencial de las mismas para formar tumores (transformación celular) y conducir a cambios en el material genético. Además, existe el riesgo potencial de que en el mismo medio de tejido crezcan por contaminación células tumor génicas que podrían tomarse para el trasplante. Para descartar estas posibilidades se harán pruebas de tumorogenicidad y cambios cromosómicos de las células madre. Las células madre que serán utilizadas para diferenciarlas y trasplantarlas, serán analizadas para tumorogenicidad a través de crio preservadas.
a) Tumorogenicidad.
Cada célula madre aislada será analizada para tumorogenicidad potencial. Después de 2 meses de incubación en los cultivos una muestra de células madre será trasplantada al cerebro de ratones, que se sacrificarán 90 días más tarde para ser analizados.

Métodos:
Las células crecerán en un medio de cultivo F12/DMEM con suplemento de crecimiento B27 y factores de crecimiento recombinantes bFGF, EGF y LIF en concentración de 20 ng/ml. Las células madre formarán neuroesferas y serán disociadas por trituración mecánica cada 12 a 15 días, cambiando el medio de cultivo cada 3er día. Cien mil células aproximadamente tomadas del medio de cultivo, serán inyectadas por métodos estereotáxicos en el hipocampo y estriado de ratones. Los animales serán sacrificados a los 90 días post inyección, en una cámara de CO2 y sus cerebros analizados para la formación de tumores. Los cerebros se extraerán y se colocarán en una solución al 4% de para formaldehído. Cortes sagitales de 15μ de espesor, hechos con un microtomo, se teñirán con hematoxilina eosina para su examen histológico.
b) Análisis cromosómico.
Anomalías en el número de cromosomas de las células madre en cultivo se determinará a través de estudios estándar de cariotipo.
c) Antibióticos.
Se agregará al medio de cultivo una solución de penicilina/estreptomicina (GIBCO) en las fases iníciales de aislamiento y crecimiento. Entre 30 a 45 días antes de trasplantarse, los antibióticos se retiraran del medio de cultivo y a partir de ese momento las células crecerán en un medio sin antibióticos.
E. Pruebas finales del tejido para trasplante. Especificación y certificación del producto.
Pruebas finales 20 días antes del trasplante. (Véase apéndices A de formatos del laboratorio y E, F, G), que contienen la siguiente información.
1. Células

a) Viabilidad (número de células vivas trasplantadas).

b) Número de células dopaminérgicas trasplantadas.

c) Producción de dopamina.

d) Porcentaje de otros tipos de células. Astrocitos GFAP positivos por ejemplo.
2. Esterilidad.

a) Contaminación microbiológica.

b) Contaminación viral.

c) Contaminación por agentes micóticos.
3. Endotoxicidad.
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