Cuestionario n° 5




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Rhodotórula sp.


Concentración del antibiótico (g/ml)

Crecimiento con Cicloheximide

Crecimiento con Cloranfenicol

100

-

+

50

-

+

25

-

+

12,5

-

+

6,25

-

+

3,115

+

+

0

+

+

a)- Explique los resultados obtenidos considerando la forma de acción de los antibióticos usados y su relación con la síntesis de proteínas.

b) ¿Cuál puede ser la causa de que aparezcan efectos secundarios cuando se utiliza un antibiótico típicamente antiprocariotas como el cloranfenicol ante una infección bacteriana en animales? Ver anexo “Antibióticos y síntesis de proteínas”.
19) La secuencia de un fragmento de DNA interno a un gen de E. coli es la siguiente:

5' C C G G C T A A G C C A T G A C T A G C 3'

3' G G C C G A T T C G G T A C T G A T C G 5'

a) Escribir las secuencias de mRNA que podrían producirse por transcripción de este segmento.

b) Identificar los codones, en todas las fases de lectura posible, de estos RNAs ¿Cuál es la secuencia de aminoácidos más probable que podría formarse por la transcripción-traducción de este fragmento?

20) La región codificadora de un gen en eucariotas está formada por cuatro exones de 99, 75, 66 y 90 nucleótidos y tres intrones, intercalados entre los exones, de 45, 63 y 42 nucleótidos, respectivamente. Indicar: a) cuántos nucleótidos tendrá el ARNm precursor; b) cuántos nucleótidos tendrá la región que se traducirá del ARNm maduro y c) cuántos aminoácidos tendrá el péptido codificado.

Extraído de Cooper, La Célula.

CUESTIONARIO N° 6

Síntesis de ARN y control genético


1) ¿A partir de qué sustratos se sintetiza ARN mensajero? ¿Sobre qué molde? ¿Se requiere de un cebador? Describa las enzimas que realizan la transcripción en procariotas y eucariotas.

  1. Describa las diferencias entre los ARN mensajeros en procariotas y eucariotas.

3) Una mutación en un gen X provoca la ausencia total de actividad biológica de la proteína codificada por el mismo. El gen X tiene una longitud de 35 Kb; el ARNm normal tiene una longitud de 2.5 Kb. Se observó que el ARNm producido por el gen mutado tiene una longitud de 4.2 Kb. ¿Cuál puede ser la naturaleza de la mutación del gen X y de qué manera afecta negativamente su expresión?

4) Defina los siguientes términos, identificando si se trata de una proteína, de un segmento de ADN (gen), o una molécula pequeña (meta­bolito) distinto de ADN y proteína.

a- Operador; b- represor; c-inductor; d-promotor; e-co-represor, f--galactosidasa; g-alolactosa.

5) Distinga los siguientes términos: enzima inducible/enzima represible; operón/promotor/operador.

6) ¿Qué papel juega el AMP cíclico (cAMP) en la transcripción de los genes del operón lactosa?

7) ¿Qué es la represión catabólica?

8) ¿Qué ocurre con la concentración intracelular de cAMP en E. coli cuan­do ésta es crecida en un medio con glucosa? Relacione su respuesta con las de las preguntas 6 y 7.

9) ¿Qué es el fenómeno de diauxia?

10) ¿Qué elementos del sistema del operón lactosa actúan en cis y cuáles en trans?
11) E. coli crece más rápido usando el monosacárido glucosa que el disacárido lactosa por dos razones:

1) La lactosa es incorporada más lentamente que glucosa y 2)- lactosa debe ser hidrolizada a glucosa y galactosa (por la ß-galactosidasa) antes de poder ser metabolizada.

Cuando E. coli crece en un medio conteniendo una mezcla de glucosa y lactosa, se observa una cinética de crecimiento compleja (Fig. 1). Esta bacteria crece más rápido al comienzo que al final de la experiencia, además existe una fase lag intermedia donde virtualmente se detiene el crecimiento. Análisis de las concentraciones de los dos azúcares en el medio muestran que la glucosa disminuye a niveles muy bajos luego de unos ciclos de división celular, pero la lactosa permanece en concentraciones elevadas casi hasta el final de la experiencia. A pesar de que la concentración de lactosa es elevada durante el experimento, la ß-galactosidasa, la cual es regulada como parte del operón lac, no es inducida hasta que han pasado más de 100 minutos.

  1. Explique la cinética de crecimiento bacteriano durante el experimento. Justifique la alta velocidad inicial de crecimiento, la baja velocidad final, y el retraso o fase lag observado.

  2. Explique porque el operón lac no es inducido por la lactosa durante la fase rápida inicial de crecimiento bacteriano.




    1. Describa el fenotipo correspondiente a los siguientes genotipos:

GENOTIPO

FENOTIPO

NO INDUCIDO

INDUCIDO

Actividad -Gal

crm

Actividad -Gal

crm

i+p-ocz+

i+p+ocz+

Ip+o z+













i+p+oczCRM













i+p+ocz+













i+p-oczCRM













i: gen que codifica el represor; p: promotor; o: operador; oc: operador constitutivo (no reconoce al represor); z: gen estructural de la -gal; zCRM: mutante del gen estructural z, que produce una enzima inacti­va, pero que es capaz de ser reconocida por los anticuerpos anti--gal. crm: cross reacting material: material que reacciona en forma cruzada con anticuerpos contra la -galactosidasa.
13) Una cepa de E. coli posee en su cromosoma el gen del represor del operón lac inactivo (i-), un promotor normal (p+), un gen operador normal (o+), y un gen de -gal que produce una enzima inactiva (z-). En esta cepa se puede introducir un plásmido que lle­va un gen represor normal (i+), un operador constitutivo, y un gen de -gal normal (z+). Completar el siguiente cuadro:





Actividad de -gal

CRM*

sin inductor, sin plásmido







sin inductor, con plásmido







con inductor, sin plásmido







con inductor, con plásmido







* Reconocimiento por anticuerpos anti-ßgalactosidasa

Cuestionario N° 7

Replicación, reparación y mutación de ADN


1) Describa el proceso de replicación del DNA, teniendo en cuenta lo siguiente:

a- Explique por qué al producirse la estructura en Y (horquilla de replicación) una de las cadenas hijas se sintetiza en fragmentos.

b- Describa la acción de todas las enzimas involucradas en el proceso de replicación del DNA.

2) ¿Qué consecuencias tendría para una bacteria la pérdida, por mutación, de la actividad exo-nucleasa de 3' a 5' de la DNA polimerasa III? Justifique.

3) Explique los siguientes conceptos

a- mutación inducida; mutación espontánea

b- mutación somática; mutación germinal

c- transición (los 4 casos posibles)

d- transversión (los 8 casos posibles)

e- mutación silenciosa; mutación neutra

f- mutación por corrimiento del marco de lectura (o "frame-shift")

g- mutación por sustitución "missense" y "nonsense"

4) Explique el modo de acción de los siguientes mutágenos y el tipo de mutación (a nivel molecular) que producen:

a- los análogos de bases (ej. 5-bromouracilo)

b- los modificadores de bases, como los agentes alquilantes (ej. etilmetanosulfato y nitrosoguanidina)

c- aflatoxina B1 (producida por el hongo Fusarium)

d- los agentes intercalantes (ej. proflavina, naranja de acridina, bromuro de etidio)

5) Complete las siguientes afirmaciones.


  1. Cada fragmento de Okazaki es sintetizado con una corta extensión de ___________ unida a su extremo ________________

  2. La mayoría de los cambios espontáneos en el ADN son rápidamente eliminados por un proceso de corrección llamado _____________________, solo raramente los procesos de mantenimiento del ADN fallan y permiten un cambio permanente en una secuencia, lo cual se conoce como ________________________

  3. Dos cambios espontáneos comunes en el ADN son _____________________, el cual resulta de la disrupción del enlace N-glicosil de adenina y guanina a la deoxiribosa, y ________________________, el cual transforma citosina en uracilo.

  4. La reparación de ADN comprende tres pasos: reconocimiento y remoción de la porción alterada de ADN por enzimas llamadas ________________________, resíntesis de la región perdida por _____________________________, y unión de los extremos por la enzima________________________________.

  5. La enzima responsable de la síntesis de ADN tanto para la replicación como para la reparación es la _______________________________.

  6. La apertura de la hélice de ADN en la horquilla de replicación es catalizada por la ________________________________, la cual usa la energía de la hidrólisis de ATP para moverse unidireccionalmente por la hebra de ADN.

  7. _______________________________, que colaboran con la apertura del ADN, se unen a hebras simples de ADN de tal modo que las bases están aún disponibles para las reacciones de apareamiento.

  8. Para bacterias y levaduras, así como para varios virus que crecen en células eucariotas, se ha visto que las burbujas de replicación se forman en una secuencia especial de ADN llamada______________________________


6) ¿Por qué posee el genoma humano miles de orígenes de replicación y el genoma de E. coli solo contiene 1?

7) En la siguiente figura se observa un cromosoma. a) Indica si es de un procariota o de un eucariota; razona la respuesta. b) ¿Qué procesos se están dando en a y en b?



8) El genoma entero de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, está constituido por 1,65x108 pares de bases. Si la velocidad de replicación de una sola horquilla es de 30 pares de bases/segundo. Calcular cuánto tiempo tardaría en replicarse el genoma entero si la replicación se inicia:

a) en un único origen.

b) en 2000 orígenes.

c) La replicación en los embriones tempranos es de 5 a 6 veces más rápida. ¿Podría este tiempo de replicación estar justificado por 16.000 orígenes?

9) El fragmento de ADN de la Fig 1. está constituido por dos hebras en los extremos pero una sola hebra en el medio. Se indica la polaridad de la hebra superior.
Fig. 1

5'_____________________________________ 3'

_________________P HO______________
a- ¿El grupo fosfato (P) en la hebra inferior esta en el extremo 5' o en el 3' del fragmento al cual esta unido?

b- ¿Cómo esperarías que la brecha sea completada por el proceso de reparación de ADN en una célula?

c- ¿Cuántas partes formarían la hebra inferior si la brecha fuera completada mediante una reacción in-vitro conteniendo solamente deoxiribonucleósidos trifosfato y ADN polimerasa?

10) El mecanismo de replicación semiconservativa fue predicho por Watson y Crick basándose en la manera de apareamiento de las bases en la doble hélice. Más tarde este mecanismo fue probado correctamente por Meselson y Stahl, quienes demostraron que cuando células de E. coli marcadas isotópicamente en su ADN replicaban su cromosoma a partir de precursores no marcados, la distribución del isótopo en las moléculas hijas luego de 1, 2 ó 3 generaciones correspondía al modo de replica­ción semiconservativa. Meselson y Stahl emplearon 15N como un marcador de densidad para el ADN y un equilibrio de sedimentación en solución de CsCl para separar las moléculas de ADN totalmente marcadas con 15N de aquellas marcadas sólo parcialmente (15N-14N) y de las no marcadas (14N), obtenidas de hacer crecer células marcadas con 15N en un medio con 14N.

Si a las células de E. coli marcadas con 15N se les permitió crecer durante 3 generaciones (aumentan su población 8 veces) en un medio con 14N.


  1. ¿Cuáles de las siguientes distribuciones de ADN totalmente marcado, parcialmente marcado y no marcado esperaría encontrar luego de extraer el ADN, con un PM promedio de 106, y determinando su densidad en un equilibrio de sedimentación?

  2. Si la replicación del ADN fuera conservativa en lugar de semiconservativa, ¿qué resultados hubieran obtenido Neselson y Stahl?

c- Leer el artículo anexo sobre replicación de ADN.
ADN 15N puro híbrido 14N-15N 14N puro

a- 1/8 1/8 6/8

b- 1/8 0 7/8

c- 0 1/8 7/8

d- 0 2/8 6/8

e- 0 4/8 4/8




11) El fármaco didesoxicitidina (utilizado para tratar ciertas enfermedades virales) es un nucleósido formado con 2`,3` didesoxirribosa. Este azúcar carece de grupo –OH tanto en las posiciones 2`como 3`. Explique porque este fármaco detendría el crecimiento de una cadena de ADN si se lo agregara al ADN.

12) Ocurren errores en la transcripción cerca de 100.000 veces más que los errores en la replicación del ADN. ¿Por qué puede tolerarse esta tasa elevada en la síntesis del ARN pero no en la síntesis del ADN?

13) ¿La sustitución de una base por otra en una zona del DNA que codifica para proteínas (mutación puntual) da lugar necesariamente a un cambio de aminoácido?

14) En la hebra codificante de un gen, el codón ATA ha cambiado por mutación a ATG. Tras una replicación de esta molécula, ¿cabría esperar algún cambio en la secuencia de la proteína codificada?

15) Una mutación puntual (C que cambia a G) en un gen bacteriano produce la aparición de un codón stop UAG en la mitad de su mensajero, lo cual provoca la pérdida de la capacidad de usar ácidos grasos como fuente de alimento.

a) ¿Cuál es el aa codificado por el codón alterado? (utilice el código genético)

Una segunda mutación en un gen que codifica para un RNA de transferencia provoca la alteración de su anticodón de manera tal que se aparea con el codón stop UAG, incorporando el aminoácido tirosina en esa posición. Tal mutación suprime los efectos de la primera, restaurando a las bacterias su capacidad de alimentarse de ácidos grasos.

b) ¿Qué cambio de base es el que determina la segunda mutación?

c) ¿Qué mecanismos garantizan:

i- que se incorpore tirosina en las posiciones correctas de esa y otras proteínas?

ii- la terminación de la traducción de aquellos mensajeros cuyo codón stop natural es UAG?

d) Discuta las consecuencias fisiológicas que puede ocasionar a la bacteria la adquisición de esta nueva mutación supresora.

16) Está estudiando una enzima en la cuál existe un residuo de cisteína activo que esta codificado por el triplete UGU. ¿Cómo afectaría a la función enzimática la mutación de la 3ra base por una C? ¿Y la mutación por una A?

17) Utilizando el código genético, indica una posible mutación en el ADN que haya podido originar los mutantes 1, 2 y 3 de la figura.

 


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