Cuestionario n° 5




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títuloCuestionario n° 5
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fecha de publicación25.01.2016
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ANEXO
El objetivo de este grupo de problemas es presentar una introducción al uso del método de Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción (RFLP, por sus iniciales en inglés) para la caracterización de muestras de ADN humano, en los análisis de paternidad y en la investigación de delitos. Tendrá Ud. la ocasión de interpretar resultados de casos reales tales como los que se obtienen en el laboratorio del FBI o en un servicio comercial de ensayo de paternidad. 
RFLP

Esta técnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la detección de fragmentos de DNA de distinto peso molecular (por digestión con la misma enzima de restricción) en diferentes organismos. Los fragmentos más fáciles de analizar son los pequeños derivados de la digestión del genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones pueden alterar significativamente el patrón de bandas identificable por electroforesis en geles de agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para moléculas de DNA de mayor tamaño, como el DNA cromosómico, el patrón de bandas es tan complejo que es necesario utilizar sondas específicas para visualizar sólo ciertos fragmentos mediante la técnica de Southern Blot. Las sondas de DNA para esta técnica suelen corresponder a genes previamente conocidos, aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecíficas. Aunque la RFLP evalúa sólo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros mapas genómicos basados en la distribución física de los genes en vez de la frecuencia de entrecruzamiento se hicieron utilizando esta técnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP




    1. Extracción del ADN


Se puede extraer ADN de casi cualquier tejido humano. Las posibles fuentes de ADN en la escena de un delito incluyen sangre, semen, tejido de una víctima muerta, células del folículo capilar y saliva. El ADN extraído de las pruebas del delito ("indicios" o "vestigios" biológicos) se compara con el extraído de muestras de referencia, obtenidas de personas conocidas, habitualmente de la sangre. 



2. Digestión del ADN con una endonucleasa de restricción
El ADN extraído de la muestra se trata con una endonucleasa de restricción, que es una enzima que corta el ADN dicatenario en donde tenga una seuencia característica. La enzima que se usa más frecuentemente para el análisis legal es HaeIII, que corta el ADN en la secuencia 5'-GGCC-3'. 



3. Electroforesis en gel de agarosa


Tras la digestión del ADN, los fragmentos de ADN resultantes se separan según su tamaño mediante electroforesis en geles de agarosa. Durante la electroforesis, las moléculas de ADN, que poseen carga negativa, migran hacia el electrodo positivo. Al avanzar las moléculas de ADN, su velocidad de migración se ve reducida por la matriz del gel de agarosa. Las moléculas menores se mueven más deprisa a través de los poros del gel que las de mayor tamaño. Como resultado, se produce una separación continua de los fragmentos de ADN de acuerdo con su tamaño, de modo que los fragmentos más pequeños avanzan la mayor distancia con referencia al origen o punto de aplicaión de la muestra.



4. Preparación de un ensayo de Southern ("Southern blot")

Tras la electroforesis, las moléculas de ADN separadas se desnaturalizan mientras permanecen en el gel de agarosa, impregnando éste con una disolución alcalina. Tras la neutralización de ésta, el DNA monocatenario resultante se transfiere a la superficie de una membrana de nailon, realizando así una copia o "calco" (la traducción más literal del inglés blot, conservando este sentido, es "secante"). Este proceso de desnaturalización y transferencia se conoce como método de Southern en recuerdo de quien lo inventó, Edward Southern. Al igual que la aplicación de un secante a un papel con la tinta húmeda transfiere una réplica de la imagen del papel al secante, el "calco" del ADN en el gel a la membrana de nailon conserva la distribución espacial de los fragmentos de ADN conseguida en el gel como resultado de la electroforesis. 



5. Hibridación con sonda radiactiva

Una sonda de locus único es una molécula pequeña de ADN o ARN capaz de hibridar (es decir, de formar un dúplex ADN-ADN o ADN-ARN) con el ADN de un fragmento de restricción concreto en el ensayo de Southern. La formación de la molécula dicatenaria (dúplex) depende del emparejamiento de bases complementarias entre las secuencias de la sonda y del ADN presente en el "calco". Las sondas de locus único se marcan habitualmente con un isótopo radiactivo para facilitar su detección, y se eligen para que detecten un locus genético polimórfico en un solo cromosoma humano. El ensayo de Southern resultante de la etapa 4 se incuba en una disolución que contiene una sonda radiactiva de locus único, bajo condiciones de temeratura y concentración de sales que favorezcan la hibridación. Tras producirse ésta, se lava el exceso de  sonda no unido, de modo que la única radiactividad que quede en la membrana de nailon sea la asociada al ADN del locus diana.



6. Detección de los RFLPs mediante autorradiografía
Las posiciones de hibridación de la sonda radiactiva sobre la membrana del ensayo de Southern se detectan mediante autorradiografía. En esta técnica, la membrana de nailon se coloca, una vez lavada, junto a una película de rayos X dentro de una caja que las aísle de la luz. La película registra las posiciones donde hay desintegración radiactiva. Tras su exposición y el revelado fotográfico, el registro resultante de la hibridación de Southern se conoce como autorradiografía ( abreviado coloquialmente en inglés a "autorad"). 



7. Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales
En un análisis legal de DNA se suelen caracterizar polimorfismos de ADN en varios cromosomas diferentes. Tras el revelado de una autorradiografía para la primera sonda, se puede lavar la radiactividad con una disolución a elevada temperatura, que deja el ADN en su sitio, e hibridarlo con una segunda sonda radiactiva que se una a un locus diferente. Se repiten así las etapas 5-7, detectando cada vez un locus diferente. El grupo de autorradiografías de una misma transferencia de Southern se conoce como un "perfil de ADN".


VNTR significa "número variable de repeticiones en tándem" (Variable Number of Tandem Repeats)


Una repetición en tándem es una secuencia corta de ADN que se repite consecutivamente, cabeza con cola, en un locus cromosómico específico. Se encuentran repartidas por todo el genoma humano. Algunas secuencias se encuentran en un solo sitio -un locus único- del genoma. Para muchas de las repeticiones en tándem, el número de unidades repetidas varía entre individuos; tales loci se llaman VNTRs. Un ejemplo de VNTR en humanos es una secuencia de ADN de 17 pb que se repite entre 70 y 450 veces en el genoma. El número total de pares de bases en ese locus puede así variar entre 1190 y 7650. 


Los VNTRs se detectan como RFLPs mediante hibridación de Southern

El método medicolegal más habitual para caracterizar los VNTRs es el uso de la hibridación de Southern, descrita en el Problema 1. Si el ADN que flanquea un VNTR se corta con una endonucleasa de restricción, el tamaño del fragmento resultante puede variar, conduciendo a un RFLP, o "polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción" (Restriction Fragment Length Polymorphism). Esto se muestra esquemáticamente en la figura, en la que los rectángulos rojos representan la unidad de repetición y los círculos azules, los sitios de corte por una endonucleasa de restrición. En esta figura, sólo se ilustran tres variantes diferentes (alelos) para el locus VNTR, pero es habitual en los loci VNTR humanos encontrar 50 o más alelos distintos.

 
Se hereda un VNTR de cada progenitor

El análisis de un locus VNTR mediante hibridación de Southern suele mostrar un patrón de dos bandas, una heredada de cada progenitor (padre y madre). Puede darse un patrón de una sola banda, si el tamaño de las dos bandas es el mismo o muy similar. Para nuestro ejemplo sencillo de tres alelos diferentes, designados A, B y C, son posibles seis perfiles distintos de ADN.

Los genotipos posibles son AA, BB, CC, AB, BC y AC, como se muestra en la figura de abajo. Cada uno de estos genotipos se puede distinguir como un patrón diferente de una o dos bandas tras la hibridación de Southern, como se aprecia en la autorradiografía de la derecha.



 
Los perfiles de ADN varían de una persona a otra

Cuando se comparan los perfiles de un solo locus VNTR para individuos no relacionados entre sí, habitualmente son diferentes. No obstante, es posible que dos personas tengan el mismo perfil en uno o dos loci por casualidad. Sin embargo, la probabilidad de que dos personas tengan el mismo perfil de ADN en 4, 5 o 6 loci VNTR diferentes es extremadamente baja. Cuando se usan los perfiles de ADN con fines medicolegales, se analizan de 4 a 6 loci VNTR diferentes.


Problema 1

Determinación de la paternidad













La autorradiografía mostrada corresponde a los resultados de un análisis de huella dactilar de ADN, con una sonda de locus único, aplicado a un varón, una mujer y sus cuatro hijos/as. ¿Cuál de los hijos/as es el que con menor probabilidad desciende de esta pareja?

Problema 2

Perfil del padre

La figura muestra los resultados del análisis de huella dactilar de ADN, con una sonda de locus único, para un varón y sus cuatro hijos/as. ¿Qué calle contiene el ADN del padre? 
Problema 3

Investigación de una violación

Esta figura muestra la parte significativa de la autorradiografía de un análisis, con sonda de locus único, de varias muestras de ADN procedentes de la investigación de una violación.

Las muestras de ADN se cargaron en las calles del gel de este modo: 

  1. Muestra de sangre de la víctima.

  2. Muestra de sangre del acusado.

  3. Marcadores de tamaño de ADN.

  4. Fracción femenina de la muestra vaginal de la víctima.

  5. Fracción masculina de la muestra vaginal de la víctima.

Si Ud. fuera el analista de ADN, debería sacar como conclusión:

A. El sospechoso es culpable.

B. El sospechoso podría ser culpable, pero deben usarse más sondas.

C. La muestra vaginal procede de una víctima errónea.

D. El sospechoso queda excluido como origen del ADN presente en la prueba del delito.

E. NINGUNA de éstas.
Problema 4

Investigación de una violación con dos sospechosos

La figura muestra la parte significativa de la autorradiografía resultante de analizar, con una sonda de locus único, varias muestras de ADN en una investigación de violación.
Las muestras de ADN fueron las siguientes:

(1) muestra conocida de sangre de la víctima

(2) muestra conocida de sangre del sospechoso A

(3) muestra conocida de sangre del sospechoso B

(4) ADN marcadores de tamaño

(5) fracción femenina de la prueba de ataque sexual

(6) fracción masculina de la prueba de ataque sexual 

Si fuera Ud. el analista de ADN, sacaría como conclusión:
A. Ambos sospechosos, A y B, quedan excluidos como origen de la prueba del delito.

B. El sospechoso A queda excluido como origen de la prueba del delito, pero no se puede descartar al sospechoso B.

C. El sospechoso B queda excluido como origen de la prueba del delito, pero no se puede descartar al sospechoso A.

D. No se puede descartar al sospechoso A ni al B como origen de la prueba.

E. No se puede descartar al sospechoso B como origen de la prueba del delito. Los resultados del sospechoso A no son concluyentes.
Problema 5

Reconstrucción del perfil de una madre ausente

En ocasiones, los científicos medicolegales deben reconstruir el perfil de ADN de una persona desaparecida o ausente a partir del estudio de los perfiles de ADN de parientes cercanos. En este caso, falta la madre de cuatro hijos/as, todos ellos con un mismo padre biológico. La figura muestra los resultados del análisis de huella dactilar de ADN, con una sonda de locus único, de los cuatro niños y del padre. Lamentablemente, el analista olvidó rotular cuál es la calle donde puso el ADN del padre.

A pesar de ello, se puede deducir que los alelos de la madre ausente son:

1. B y C

2. A y B

3. A y C

4. B y D

5. A y D
VER ANEXO CON LAS FIGURAS DE CADA PROBLEMA.


Problema 1 Problema 2 Problema 3



Problema 4 Problema 5
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