Resumen Los análisis de adn gozaron desde sus inicios de un aura de infalibilidad que no estaba de acuerdo con la condición humana de quienes ejecutaban tales estudios, que por supuesto podían cometer errores tanto operativos como de interpretación.




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títuloResumen Los análisis de adn gozaron desde sus inicios de un aura de infalibilidad que no estaba de acuerdo con la condición humana de quienes ejecutaban tales estudios, que por supuesto podían cometer errores tanto operativos como de interpretación.
fecha de publicación16.01.2016
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¿SON INFALIBLES LOS ANALISIS DE ADN? Errores y dificultades más frecuentes de los estudios genéticos.

POR GUSTAVO A. PENACINO *




Resumen


Los análisis de ADN gozaron desde sus inicios de un aura de infalibilidad que no estaba de acuerdo con la condición humana de quienes ejecutaban tales estudios, que por supuesto podían cometer errores tanto operativos como de interpretación. El desconocimiento que existía en un principio de los fundamentos y características de los análisis de ADN, inducía a Magistrados y abogados a suponer que se trataba de una "caja negra" en la que se introducían las muestras y salían "veredictos" de culpabilidad o inocencia. En el presente trabajo se expone una breve reseña histórica que muestra la evolución de estas prácticas; y las manipulaciones a que son sometidas las muestras desde su llegada al laboratorio hasta la interpretación de los resultados, con el objeto de posibilitar la comprensión del problema y sus posibles soluciones.
1- Los análisis de ADN revolucionan la Bioquímica Forense.
A partir del descubrimiento de polimorfismos hipervariables en el ADN por Wyman and White (1980), y de la posibilidad de emplearlos en identificación humana, lograda por Jeffreys (1985), los rangos de probabilidad de exclusión se incrementaron enormemente, a más del 99,99 %, superando incluso a la aplicación de todos los sistemas anteriores en conjunto.
Reseña histórica
En orden cronológico, puede decirse que el puntapié inicial de los análisis de ADN se produce en abril de 1985, cuando el primer caso judicial es resuelto por aplicación de técnicas moleculares de caracterización de secuencias hipervariables en el ácido desoxirribonucleico (ADN).

Los resultados obtenidos mediante el estudio de las Huellas Digitales Genéticas (HDG) o "DNA-Fingerprinting" permitieron aclarar una disputa por inmigración a Gran Bretaña. Poco tiempo después, una corte civil inglesa acepta la evidencia de ADN en un caso de paternidad discutida.

El debut de esta prueba en la investigación criminal se produce en octubre de 1986, en un caso de homicidio en el que se comprobó la inocencia del principal sospechoso.

Recién a partir del año 1987, las pruebas de ADN son admitidas como evidencia en las Cortes Criminales de Gran Bretaña y de Estados Unidos.

En 1988 se desarrollan técnicas de amplificación de ADN de pequeñas regiones variables del genoma, partiendo de sólo 1700 células diploides, equivalentes a unos 10 nanogramos de ADN.

Estas técnicas, denominadas genéricamente reacción en cadena de la polimerasa ("Polymerase Chain Reaction" o PCR), emplean iniciadores o primers, que son secuencias de ADN complementarias de las zonas flanqueantes de la zona de interés, que es amplificado por una ADN polimerasa durante ciclos térmicos adecuados, lográndose millones de copias de la región.

En 1989, y a causa de estudios de dudosa verosimilitud efectuados por la

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*GUSTAVO A. PENACINO: Bioquímico, Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área de Genética y Biología Molecular. Vicepresidente de la Sociedad Argentina de Genética Forense e integrante del Servicio de Huellas Dig. Genéticas (Fac. Farmacia y Bioquímica - UBA)

empresa americana Lifecodes Corp. en un caso criminal, se discute en los Estados Unidos la validez científica de estas pruebas para uso forense (Lander, 1989), resultando en una revisión crítica de las técnicas utilizadas por los distintos grupos de investigadores.

En 1990, el U.S. Congress Office of Technology Assessment concluye que la identificación de individuos basada en las pruebas de ADN es científicamente válida, siempre que se disponga de la certeza metodológica de su realización. La estandarización de las mismas ha sido encarada, entre otros, por los laboratorios del FBI.

La razón fundamental de la amplia difusión de estas técnicas estriba en el hecho de que, mientras la serología clásica y los marcadores genéticos evaluables fenotípicamente presentan un número muy limitado de genotipos posibles, el continuo descubrimiento de nuevas regiones hipervariables en el ADN resuelve el problema de la identificación certera de individuos y del establecimiento de vínculos biológicos de parentesco.

En los primeros trabajos con utilización de las técnicas de PCR, si bien resultaba posible evaluar regiones de una muestra de ADN que podía estar muy degradada, la escasa variabilidad entre los individuos componentes de la población general conspiraba contra la certeza incriminatoria del análisis: era factible que una evidencia coincidiera con un sospechoso por azar, y mucho más aún, que a un padre alegado le fuera atribuida erróneamente la paternidad biológica de un descendiente putativo.

A partir de los ´90, la posibilidad de evaluar un gran número de sitios variables localizados en diferentes zonas del genoma, permitió analizar, aunque fuera parcialmente, muestras de tejido humano quemado y en estado de putrefacción, como las derivadas de los atentados a la Embajada de Israel y a la mutual israelita AMIA.

Posteriormente, la incorporación de un número aún mayor de sistemas hizo posible el establecimiento de vínculos biológicos de parentesco a través de secuencias de ADN de muy pequeño tamaño, con lo cual se logró la identificación de cadáveres momificados, con reducción ósea total o quemados.
2- La reacción en cadena de la polimerasa o PCR.
La amplificación mediante PCR requiere pequeñas secuencias de ADN sintético los que actúan como iniciadores o primers, que son complementarios de las regiones flanqueantes de la zona de interés. Se produce mediante varios ciclos (generalmente de 25 a 35), cada uno de los cuales consta usualmente de tres pasos, efectuados mediante cambios de temperatura:

I- Desnaturalización: ruptura de los puentes de hidrógeno, quedando el ADN como simple cadena.

II- Reasociación o annealing: los primers se reasocian a las zonas complementarias.

III- Extensión: se sintetiza ADN, con los nucleótidos y una ADN polimerasa que se hallan en la mezcla de reacción, generándose al final del proceso millones de copias de la región de interés.
Esquemáticamente, la reacción de amplificación se representa en la Figura 2.



Figura 2
El uso de la enzima termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus, denominada Taq polimerasa para la "extensión" (Saiki et al, 1988), permitió la automatización del proceso mediante el empleo de cicladores térmicos electrónicos.
Evaluación de microsatélites:
Cada unidad de repetición de los microsatélites posee entre 2 y 5 nucleótidos, por lo cual se requiere la amplificación por PCR y evaluación posterior mediante geles de poliacrilamida (PAGE), similares a los empleados en secuenciación de ADN, que permiten discriminar diferencias de longitud de sólo un nucleótido.

Estas pequeñas secuencias presentan un número variable de repeticiones en tándem (STRs o “short tandem repeats”), desarrollándose los "primers" necesarios para su amplificación. Edwards et al (1991) describen 10 sistemas distintos, localizados en los cromosomas 1, 4, 6, 7, 11, 12 y X, que involucran secuencias repetidas de 3 ó 4 bases.

Desde entonces, se incorporaron un número creciente de microsatélites, hallándose disponibles en este momento kits comerciales que permiten la amplificación y análisis de 16 sistemas en una sola reacción, con la ayuda de un secuenciador automático.
Variantes de ADN mitocondrial
Dentro de los sistemas cuya variación reside en la secuencia de nucleótidos, merece especial atención el estudio del ADN presente en las mitocondrias. En el año 1981, Anderson y col. publican la secuencia completa del genoma mitocondrial (Anderson et al., 1981), de aproximadamente 16,5 Kb, que presenta una región no codificante, denominada D loop, donde se encuentra el origen de replicación, y que se caracteriza por presentar sitios con elevado índice de mutación.

Debido a que la información contenida en la secuencia mitocondrial es heredada a partir de la vía materna exclusivamente esto permite establecer vínculo de parentesco entre individuos maternalmente relacionados. El análisis de la secuencia permite diferenciar un individuo de otro de distinto linaje materno.

Esta característica, sumada a que cada célula contiene una gran cantidad de mitocondrias y por ello el genoma mitocondrial se halla mucho más representado que el contenido en el núcleo celular, hace que este sistema sea de suma utilidad, principalmente en los casos de material ampliamente degradado.

A partir del análisis de esta secuencia han sido caracterizados restos arqueológicos de varios miles de años de antigüedad, en los que fue factible obtener ADN mitocondrial relativamente bien conservado.
Análisis de marcadores variables ubicados en el cromosoma Y humano:
Estos marcadores adquieren particular importancia en ausencia de progenitor masculino: si se cuenta con otro familiar masculino de la línea paterna, su cromosoma Y será idéntico al del padre no disponible y su supuesto hijo.

Un análisis detallado del cromosoma Y podría hacer innecesarias las exhumaciones para determinar paternidad de un fallecido sobre un hijo varón, si se cuenta con hermanos reconocidos, tíos o abuelos paternos del supuesto hijo.

Además, en el análisis de muestras como hisopados y ropa interior, provenientes de violaciones, es posible evitar la interferencia del material biológico femenino (víctima).

En los casos en que la víctima es un hombre, los resultados obtenidos también son claros a pesar de la mezcla, y el patrón genético del violador puede inferirse restando el correspondiente a la víctima.
3- El trabajo de laboratorio.
Extracción del ADN:
La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción de detergentes, que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas.

Luego de incubar la mezcla una noche a 60 grados centígrados, se produce la ruptura de la estructura celular liberando todo su contenido a la solución.

La mezcla se limpia mediante sucesivos lavados con solventes orgánicos (fenol, cloroformo), que coagulan proteínas y extraen los lípidos, y finalmente el ADN se separa por precipitación con alcohol en medio salino.

Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos.

Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se deposita sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeños fragmentos del papel (alrededor de 1 mm) y se extraen las impurezas mediante lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente colocándolo en la mezcla de amplificación.
Análisis del ADN:
Existen dos metodologías diferentes:
a) Corte con enzimas de restricción, corrimiento electroforético en geles de agarosa, transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento con sondas de locus múltiple o de locus específico. Estas técnicas han caído en desuso, por lo cual no serán tratadas aquí.
b) Amplificación mediante PCR o reacción en cadena de la polimerasa: es un proceso que consiste en imitar una actividad normal de la célula: la copia de ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en los cuales están ubicadas las regiones variables.

Para ello, se coloca en cada tubo una porción del ADN extraído de cada persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que "copia" ADN (denominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable.

La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador térmico, que produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión de la cadena copiada, mediante la unión de los nucleótidos que se encuentran en la solución, con la ayuda de la polimerasa.

Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior de un soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más rápido que los grandes, produciendo su separación.
Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes métodos:
- Radiactivos: si uno de los nucleótidos estaba marcado radiactivamente, basta poner el gel en contacto con una película radiográfica, que se revela para observar las variantes.

- Tinción con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga positiva son atraídas por la carga negativa de los fragmentos de ADN, y se revela de modo similar a una fotografía.
Tanto los métodos radiactivos como los de tinción con plata están cayendo en desuso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que poseen un escaso volumen de trabajo.
- Sistemas automatizados: son los de última generación, en los cuales al proceso de electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee mediante un rayo laser los "primers", marcados con un fluorocromo, adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar qué variantes son las que se encuentran en cada muestra.
Interpretación de los resultados:
Según las metodologías empleadas, los resultados se visualizan como "bandas" (en los formatos radiactivos o de tinción con nitrato de plata) o como "picos" en un gráfico (sistemas automatizados). Dado que la interpretación es idéntica, en los ejemplos utilizaremos los gráficos obtenidos de un secuenciador automático.

1- En estudios de paternidad y/o maternidad:
Considerando que cada individuo hereda una variante de su madre y la otra de su padre biológico, supongamos los siguientes resultados para un hipotético "sistema A":



Madre:


Hijo:

Padre alegado:




Es evidente que el hijo comparte una variante con su madre y la otra con su padre alegado, por lo cual podría ser hijo de ambos. Sin embargo, esa situación puede darse por azar, ya que hay muchos individuos de la población general que presentan esa variante compartida.

Entonces, repetimos el estudio con otro sistema, que analizará una zona variable diferente. El resultado para ese "sistema B" podría ser:



Madre:


Hijo:

Padre alegado:




y se confirmaría la inclusión. Para que el estudio resulte suficientemente creíble, se acepta a nivel mundial que deben analizarse un mínimo de 12 sistemas de microsatélites, por supuesto, con inclusión en todos los casos. Para las técnicas actuales automatizadas, ello no presenta ningún inconveniente, ya que existen métodos de amplificación de 15 regiones variables en una sola reacción.

El estudio completo, con sistemas de última generación, como los empleados en el Servicio de Huellas Digitales Genéticas (FFyB-UBA), se vería así:


Madre:

Hijo:

Padre alegado:








Madre:

Hijo:

Padre alegado:







Madre:


Hijo:

Padre alegado:




En el ejemplo anterior, se observan 15 sistemas variables y además el denominado "amelogenina", que sirve para determinación de sexo: en lo varones se aprecian dos picos ("XY") y en las mujeres, sólo uno ("XX").
Otra posibilidad para el sistema B sería:



Madre:

Hijo:


Padre alegado:




que indicaría la exclusión del padre alegado como padre biológico. Para asegurarse que no se deba a una falsa exclusión debida a una mutación, se sugiere continuar el estudio hasta observar al menos tres situaciones como ésta (de no compartición de variantes entre padre e hijo alegado).

Las variantes mencionadas se codifican por convención mediante un número (ubicado en el esquema en la parte inferior de cada pico), que expresa el número de veces que está repetida la secuencia que caracteriza al sistema. Así, en nuestro hipotético "sistema A", los resultados se expresarían como:
Madre: 8-12.

Hijo: 8-13.

Padre alegado: 12-13.
Cualquier otro estudio, realizado en cualquier lugar del mundo, del mismo "sistema A", debe necesariamente arrojar los mismos resultados numéricos. Si eso no ocurre, alguno cometió un error.

Finalmente, se realiza un cálculo estadístico de la probabilidad de paternidad e índice de paternidad, basándose en análisis efectuados previamente de las variantes observadas en individuos no relacionados de la población general. Cuanto menos frecuentes en la población sean las variantes obtenidas, mayores serán la probabilidad y el índice de paternidad.

Habitualmente, para individuos vivos, la "probabilidad de paternidad" es superior al 99,99%. Por ejemplo, un "índice de paternidad" de 1,2 x 106 indica que 1 de cada 1200000 individuos de la población general podrían ser asignados como padres biológicos del hijo en cuestión, sin serlo, es decir, por azar.
2- En estudios de identidad entre evidencias y sospechosos:
En estos casos la interpretación es mucho más sencilla, ya que todos los sistemas deben coincidir exactamente para que dos muestras biológicas correspondan al mismo individuo.

Por ejemplo, si se estudia una colilla de cigarrillo, el resultado debe coincidir totalmente con el material sanguíneo indubitado del sospechoso para concluir que pertenece a él.

Si se analiza un hisopado o una prenda de una mujer que ha sufrido una violación, el patrón genético obtenido debe ser idéntico al de la muestra sanguínea del sospechoso, o a una mezcla víctima-sospechoso, para suponer la participación del imputado en el hecho.
4- La "infalibilidad" de los resultados.
A principios de los ´90 y hasta hace pocos años, el resultado de un análisis de ADN era considerado completamente infalible y exento de error, debido probablemente a los altos porcentajes de "probabilidad de paternidad" o de "probabilidad de coincidencia evidencia-sospechoso", que "superaba el 99%". Sin embargo, analizando la cuestión en profundidad surge que:
a) Análisis matemático: una "certeza" del 99% implica que uno de cada 100 hombres presenta características genéticas compatibles con el hijo alegado por azar, de modo que en una ciudad de un millón de habitantes, a 10.000 hombres les sería atribuida la paternidad por error. Algo similar ocurriría para la coincidencia entre una mancha y un sospechoso.

En consecuencia, el "porcentaje" no representa un valor confiable, por lo cual actualmente se emplean el "Índice de Paternidad" y el "Índice de coincidencia", que reflejan mejor la confiabilidad del resultado.
b) Recolección y remisión de las muestras: el Magistrado debe asegurarse de que la toma de muestras en la escena del crimen se llevó a cabo con las máximas precauciones, para evitar contaminaciones o mezclas que confundirán o desviarán la investigación: cómo se interpreta el patrón genético de una colilla "olvidada" por uno de los investigadores al lado del cadáver y recolectada luego como una prueba decisiva?
c) Errores de manipulación dentro del laboratorio:


  • es imposible que quien recibe las muestras confunda los tubos?

  • es imposible que en el proceso de extracción del ADN el laboratorista rotule un tubo con el nombre de otra persona por error?

  • es imposible que al efectuar la reacción de amplificación simultánea de 96 muestras en pequeños tubos de 1,5 cm de altura se produzca un cambio involuntario al colocar las muestras de ADN extraído?

  • es imposible que al inyectar las muestras en el secuenciador automático el operador las identifique erróneamente?


Desde luego, sin necesidad de conocer demasiado sobre análisis de ADN, podemos responder que NO a todas las preguntas anteriores.
d) Errores de interpretación de los resultados:


  • es frecuente que algunos sistemas presenten picos adicionales, que los operadores con escasa experiencia pueden interpretar como mezclas de fluidos biológicos.

  • En muestras de material cadavérico se aísla muy escaso material analizable. A veces, en un momento de descuido el analista habla o toca sin guantes el interior del tubo o las puntas de las pipetas automáticas, produciendo una contaminación que luego se manifiesta frente a la escasez del ADN cadavérico, y lleva a interpretar el resultado como una EXCLUSION de la paternidad o maternidad. Antes de confirmar una exclusión, deben realizarse varias extracciones con diferentes porciones de material cadavérico, con resultados idénticos entre sí.

  • No siempre el hijo hereda de cada padre una variante, existen eventos raros denominados "mutaciones", en las cuales el hijo presenta una banda o pico que no está en ninguno de sus padres biológicos. Esta situación puede darse una vez cada 500 estudios o más, pero laboratorios con escasa experiencia pueden interpretarla como EXCLUSION de la paternidad.

  • En los estudios de evidencias provenientes de violaciones, constituidos por mezclas de fluidos biológicos, pueden ocurrir "amplificaciones selectivas" de algunas variantes en detrimento de otras, con lo cual alguno de los alelos puede no detectarse.

  • A veces, en material cadavérico ocurre un fenómeno similar y se observa una sola variante en vez de las dos que tenía el individuo vivo. Si justamente el alelo "ausente" es el que compartía con su progenitor, se puede interpretar equivocadamente como EXCLUSION. La solución es analizar diferentes diluciones del ADN extraído, ya que suele "aparecer" la variante perdida en esas condiciones. Sin embargo, laboratorios con escasa experiencia o recursos limitados, no efectúan estos nuevos estudios.



CONCLUSIONES



Los análisis de ADN son altamente confiables pero no infalibles, como toda actividad humana.
Para minimizar la posibilidad de error, es necesario:
1- Instruir mediante cursos y seminarios, al personal judicial o policial que efectúa la toma y conservación de las muestras.
2- Instruir mediante cursos y seminarios a Magistrados y abogados en lo que respecta a interpretación de los resultados.
3- Constituir Centros de Referencia en los cuales se lleve a cabo el entrenamiento de personal habilitado para realizar estudios de ADN.
4- Implementar Controles de Calidad obligatorios para todos los laboratorios que presten servicios a la Justicia. El autor del presente trabajo coordinó el desde el Servicio de Huellas Digitales Genéticas, el Primer Control de Calidad de la Sociedad Argentina de Genética Forense, en el cual participaron más de 30 laboratorios de toda Latinoamérica, realizado el año pasado. Previamente, en 1998, desde el mismo Servicio se efectuó otro Control de Calidad de similares características. Sin embargo, ambos controles fueron optativos y anónimos, para animar a participar a centros con escasa experiencia. En el futuro, se espera hacerlos en condiciones más estrictas para asegurar la calidad de los resultados.





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