Trabajo Práctico Nº 5 “mitosis”




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títuloTrabajo Práctico Nº 5 “mitosis”
fecha de publicación24.01.2016
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Universidad Nacional de Chilecito Cátedra de Genética 2014




Trabajo Práctico Nº 5

“MITOSIS”



OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

Reconocer microscópicamente las distintas fases de la división mitótica y algunas de sus características.-
MATERIALES A UTILIZAR

Raicillas jóvenes de Allium cepa (cebolla), herramientas de laboratorio e instrumental óptico adecuado. Se utiliza como material biológico a la cebolla por la facilidad para obtener sus preparaciones cromosómicas, esto se debe a que posee pocos cromosomas (2n=16) y los bulbos enraízan fácilmente generando abundante material.-
TRABAJO A REALIZAR EN EL LABORATORIO

1) Obtención de preparados temporarios que se realizarán durante la clase práctica de acuerdo a las instrucciones de esta guía.-

2) En los preparados propios o en los facilitados por el docente, observar y dibujar células en los diferentes estadíos de la división mitótica (Interfase, Profase, Metafase, Anafase y Telofase), destacando las características de los mismos, especialmente la aparición o desaparición de estructuras cuya presencia o ausencia caracteriza éstas etapas (membrana nuclear, nucléolos, huso acromático, etc.). Observar cromocentros o cromatina en interfase y profase. Aclaración: dibujar los diferentes estadíos en su secuencia real para facilitar su estudio y análisis posterior.

3) Observar la morfología de los cromosomas, prestando particular atención a la posición de los centrómeros y presencia de constricciones secundarias y satélites.
CICLO MITÓTICO

Simultáneamente a las observaciones que realiza en los puntos anteriores deberá registrar los parámetros necesarios para el análisis del ciclo mitótico.

1) Calcular el índice mitótico a partir de 250 células observadas barriendo el campo óptico de derecha a izquierda y de arriba hacia abajo, de acuerdo con la fórmula siguiente:



IM =

Número de células en división

x 100

Número total de células observadas


2) Identificar 50 células en división y registrar las fases en que se encuentran.

3) Con los datos obtenidos en el apartado anterior y los registrados por sus compañeros, calcule la duración relativa de cada fase mitótica mediante el índice de fase:


IF =

Número de células en esa fase

x 100

Número total de células en división

TÉCNICA OPERATORIA

Una de las técnicas más frecuentemente empleadas en el estudio de cromosomas mitóticos se denominada “técnica de aplastamiento” (squashing), mediante la cual se puede hacer recuentos cromosómicos y estudiar la morfología de los cromosomas, y consiste de los siguientes pasos:

1) Poner a enraizar bulbos (o semillas) y cortar las raíces enteras cuando alcanzan entre 5 mm y 1 cm, es decir mientras las células del ápice se hallan en crecimiento activo.

2) Sumergir las raicillas durante 1 a 4 horas en algún veneno mitótico para inhibir la formación del huso acromático. Los venenos más utilizados son las soluciones acuosas saturadas de paclosol (Paradiclorobenceno), gamexane y alfa-bromonaftaleno (Naftalina) y, también, solución de colchicina al 0,05-1% o solución 0,002 M de 8-Hidroxiquinoleina; la elección de inhibidor dependerá del material biológico en estudio. Como resultado de dicha inhibición se acumulan células en Metafase, los cromosomas se distribuyen por toda la célula en lugar de hallarse amontonados en la región ecuatorial y, además, los cromosomas se contraen facilitando el estudio de su morfología.

Aclaración: este paso solo se efectúa si se desea estudiar la morfología de los cromosomas metafásicos, si el objetivo planteado es estudiar los estadíos normales de la mitosis debe suprimirse.

3) Fijar en una solución de alcohol etílico y ácido acético glacial en proporción 3:1 durante 12 a 24 hs (en caso de apuro se puede reducir el tiempo a 1 ó 2 hs)

4) Si las preparaciones cromosómicas no se realizan inmediatamente, conservar en etanol al 70% a 4ºC, donde el material puede conservarse en buen estado durante varios meses.

5) Transferir las raicillas a un vidrio de reloj con ácido clorhídrico (HCl 1N) a temperatura ambiente durante diez a treinta minutos, dependiendo del material, para disolver el cemento péctico de la pared celular.

6) Colocar las raicillas sobre el portaobjetos; con ayuda del instrumental óptico adecuado retirar la cofia y cortar los meristemas apicales que se distinguen más blancos.

7) Colocar una pequeña gota del colorante utilizado (Orceína Acética 2%, Orceína Lactopropiónica 2%, Carmín Acético 2%, etc.), disgregar los tejidos apicales con una barra metálica de extremo plano y colocar el cubreobjetos. Agregar colorante por los bordes si es necesario.

8) Si es necesario, flamear en mechero para aclarar el citoplasma y aumentar el contraste de los cromosomas, de esta manera se diferencian mejor. El calentamiento no debe superar los 50ºC aproximadamente. La temperatura debe controlarse con la mano; el colorante no debe hervir y bastan unos pocos y breves pasajes por la parte superior de la llama.

9) Realizar un squash (aplastado). Para ello se colocan los preparados entre papeles absorbentes, se sostiene con los dedos de una mano y se hace presión verticalmente con el pulgar de la otra mano en el centro del cubreobjetos. Evitar el deslizamiento del cubre sobre el portaobjetos ya que rompen o enrollan las células.

10) Examinar al microscopio óptico convencional con el objetivo de menor aumento. Si no se observan grandes agrupaciones de tejido y las células están suficientemente aplastadas, se sella la preparación solución de goma comercial. De lo contrario, si faltara aplastamiento se instilan 1 o 2 gotas del colorante por los bordes del cubre y se un nuevo squash.

11) Recorrer completamente el preparado con el objetivo de 10x, siguiendo un movimiento ordenado de la platina de derecha a izquierda y de arriba hacia abajo, y contar las células para calcular el índice mitótico e índice de fases. Ubicar las mejores células en cada una de las fases y anotar su posición leyendo el Vernier de la platina para estudiarlas posteriormente a mil aumentos con objetivo de inmersión.

Fotografía de las fases de la mitosis de Allium cepa


Trabajo Práctico N° 6

“MEIOSIS”



OBJETIVO

Reconocer las distintas fases de la división meiótica y algunas de sus características más sobresalientes. Comprender la importancia de cada una de las etapas de este proceso biológico.

MATERIALES A UTILIZAR

Gónadas masculinas de ortópteros de distintos géneros y especies. Se utiliza este material biológico dado que posee sólo cromosomas telocéntricos y facilita la interpretación de las configuraciones cromosómicas observadas. Instrumental óptico y herramientas de laboratorio adecuadas.

TRABAJO A REALIZAR EN EL LABORATORIO

1) Obtener preparados temporarios que se realizarán durante la clase práctica siguiendo las instrucciones de la técnica operatoria que se detalla a continuación.

2) Observar y dibujar, en forma esquemática, células en diferentes fases de división (Interfase, Leptotene, Cigotene, Paquitene, Diplotene, Diacinesis, Metafase I, Anafase I, Telofase I, Metafase II, Anafase II, y Telofase II). En cada uno de los esquemas remarcar las características sobresalientes de la etapa, por ejemplo:

a) Dibujar detalladamente un bivalente (II) en paquitene, donde se vea la organización cromomérica y el apareamiento cromómero a cromómero. Observar la heteropicnosis positiva del univalente sexual X.

b) En diplotene temprano observar y dibujar la repulsión precoz de los extremos del bivalente y la heteropicnosis positiva del cromosoma X. Notar que éste último está compuesto por dos cromátidas hermanas.

c) En diplotene avanzado observar la repulsión de los homólogos y dibujar un bivalente en el que sean notorias las 4 cromátidas que lo componen. Dibujar el X hetrocromático.

d) En diacinesis graficar la configuración de los bivalentes y destacar la heterocromaticidad del X con respecto a los autosomas.

e) En diplotene, diacinesis y metafase I marcar los quiasmas proximales, intersticiales y distales, señalándolos con una flecha y colocando las iniciales qp, qi y qd. En las células dibujadas calcular el coeficiente de terminalización de quiasmas, que es la proporción de quiasmas distales (qd) con respecto al total de quiasmas en la célula.
TÉCNICA OPERATORIA

Introducción Teórica

Se estudiará la meiosis en gónadas masculinas de distintas especies de Acrídidos (Orthoptera) de la provincia de Misiones. Los testículos de estos insectos, si bien de morfología general variable, presentan una estructura folicular típica. Los folículos son sacos ciegos más o menos alargados que desembocan en un conducto deferente común. En cada folículo la meiosis es cística, y en la región apical del folículo se encuentra la zona germinal en donde se producen las espermatogonias. Un cisto consiste de un grupo de espermatogonias que provienen por mitosis de una única célula original, que entran simultáneamente en meiosis y la cumplen en forma sincrónica. Por tal motivo en un cisto todas las células se encuentran en el mismo estadío de división; cuanto más distal es un cisto dentro del folículo más avanzado es el estadio meiótico en que se encuentran las células.

Obtención de preparaciones citogenéticas temporarias

1) Después de eterizar al animal, extraer los testículos practicando una incisión dorso lateral a la altura del 2º segmento abdominal y ejercer una presión leve sobre el abdomen para que los testículos emerjan.

2) Pegar los testículos a un papel de filtro debidamente rotulado; fijarlos en una solución 3:1 de metanol absoluto : ácido acético glacial durante 30 a 120 min como mínimo. El material fijado se puede conservar a 4º en el mismo fijador o en etanol al 70%.

3) Colocar entre 2 y 6 folículos (de acuerdo a su tamaño) sobre un portaobjetos, agregar una gota de hematoxilina férrica u orceína lactopropiónica al 2%. Dilacerar el material con una barra de metal (hierro) de extremo plano.

4) Colocar un cubreobjetos, no flamear. Realizar el squash de la manera habitual y sellar el preparado con solución de goma o cera depilatoria, según el tratamiento que se practique posteriormente. Los preparados pueden hacerse permanente transcurridas dos horas como mínimo.

Obtención de preparaciones permanentes

a) Por congelación:

1) Retirar el sellador con ayuda de un bisturí u hoja de afeitar. Evitando los deslizamientos del cubreobjetos, limpiar los restos de sellador con papel absorbente embebido con xilol.

2) Congelar el preparado colocándolo sobre un trozo de hielo seco (30 seg), por exposición a un flujo continuo de CO2 o por inmersión en nitrógeno líquido.

3) Saltar el cubreobjetos con ayuda de un bisturí u hoja de afeitar.

4) Sumergir el portaobjetos y el cubreobjetos en alcohol absoluto durante 1 minuto.

5) Lavar el portaobjetos con alcohol absoluto 2 ó 3 veces.

6) Colocar una gota de medio de montaje soluble en alcohol (Euparal). En el caso de utilizar un medio montaje soluble en xilol (Xam o DePeX), realizar un pasaje por xilol antes del montaje definitivo.

7) Colocar un nuevo cubreobjetos limpio y seco.

8) El cubreobjetos original se trata de manera similar al portaobjetos y se asocia con un nuevo portaobjetos limpio y seco.

9) Si se observa alguna turbidez generada por hidratación, calentar suavemente a la llama hasta que desaparezca. Nunca debe hervir el medio de montaje definitivo.

10) Estacionar durante 24 hs. a 37ºC antes de observar para que se seque el medio de montaje.

Aclaración: es aconsejable el uso de cubreobjetos siliconados para evitar que las células se adhieran a él y, de esta forma, trabajar únicamente con el portaobjetos al hacer permanente la preparación.

b) Desprendimiento del cubreobjetos por inversión:

1) Retirar el sellador con ayuda de un bisturí u hoja de afeitar evitando que se deslice el cubreobjetos.

2) Limpiar los bordes del cubreobjetos con xilol y luego con ácido acético 45% para eliminar los restos de sellador.

3) Colocar el preparado de manera invertida (con el cubreobjetos hacia abajo) dentro de una Caja de Petri y sobre una varilla de vidrio doblada en U, agregar ácido acético al 10% y esperar hasta el desprendimiento del cubreobjetos.

4) Lavar dos veces el portaobjetos con alcohol 96º, 1 minuto cada vez, dejando gotear el alcohol desde el borde del vidrio.

5) Repetir el procedimiento anterior con alcohol etílico absoluto. Evitar la desecación.

6) Agregar una gota de Euparal y continuar el procedimiento como en la técnica anterior. En caso de utilizar medios de montajes solubles en xilol, realizar previamente un lavado con este hidrocarburo.






Meiosis en ortópteros: células en diplotene, diacinesis y metafase I de diferentes especies de orthoptera y sus correspondientes esquemas de interpretación. c: Centrómero; ch: Quiasmas; x: cromosoma x monovalente.





Figura 1. Células del testículo del saltamontes Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto propiónica. A.  Núcleo de una espermatogonia en interfase. El cromosoma sexual ha sido señalado con una X. B.  Metafase espermatogonial. C.  Núcleo prepaquiténico. Posiblemente corresponde a un núcleo en leptotene. D.  Paquitene medio. E.  Paquitene tardío. F.  Diplotene. Se ha señalado la posición de los quiasmas en un bivalentemonoquiasmático (M7), en uno con dos quiasmas (M4) y en un tercero que presenta cuatro (L1).





Figura 2. Espermatocitos de Chorthippus jucundus teñidos con orceína lacto propiónica.A.  Diplotene tardío diacinesis. B.  Metafase I. C.  Anafase I. El cromosoma sexual X migra completo al polo superior de la célula. D.  Telofase I. E.  Intercinesis/Profase II. La célula de la parte superior de la fotografía posee el cromosoma X, mientras que la de la parte inferior carece de él.





Figura 3. Células del testículo de Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-propiónica. A.  Metafase II. Se observa la disposición radial de los cromosomas. B.  Anafase II. Las cromátidas están comenzando a separarse. C.  Anafase II. D.  Telofase II. E.  Espermátidas tempranas. La situada en la parte superior de la fotografía posee el cromosoma sexual (X), mientras que la de la parte inferior carece de él. F,G,H  Espermátidas en diferentes estados de maduración.



Créditos por las figuras: http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm

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