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fecha de publicación24.01.2016
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Equipos GSSP SeCore®

Instrucciones de uso
Equipos GSSP SeCore®

Instrucciones de uso
Los GSSP (Productos para secuenciación específicos de grupo) SeCore® de Invitrogen han sido diseñados para resolver combinaciones ambiguas del HLA en heterozigosis, y se usan conjuntamente con los equipos para secuenciación SeCore® . Los reactivos son para uso exclusivo en la secuenciación postamplificación. Para conocer las instrucciones acerca de cómo preparar la amplificación del ADN genómico de locus específico, los usuarios deberán consultar las secciones 1 a 6 de las Instrucciones de uso del equipo para secuenciación SeCore® .
Cada equipo GSSP SeCore® contiene un vial con cebador para la secuenciación específica de grupo, un vial con el BigDye® y un vial con tampón de PPT de secuenciación. El amplicón tratado ExoSAP-IT™, preparado con el equipo para secuenciación SeCore® , sirve de plantilla para las reacciones de los GSSP. Los datos generados a partir de los GSSP se analizan junto con los datos originales del equipo para secuenciación SeCore® correspondiente para determinar el resultado de la secuencia.


Contenido del manual:


Sección

Descripción

Página

1.

Componentes del equipo

3

2.

Materiales, reactivos y equipo no suministrado

3

3.

Preparación de la muestra

4

4.

Reacción de secuenciación

5

5.

Precipitación de etanol de productos de reacción de secuenciación

5

6.

Electroforesis de los productos de reacción de secuenciación

6

7.

Análisis de datos

7

8.

Limitaciones y precauciones

7

9.

Solución de problemas

8

10.

Licencias y marcas comerciales

10


1Componentes del equipo:



Los equipos de GSSP SeCore® de Invitrogen se suministran como locus y/o grupos independientes. Los productos de clase I se designan por un número “Z” y los equipos de clase II se designan por los locus/grupos “DR”. Consulte los equipos específicos para identificar los locus/el grupo.

Descripción

Cantidad

Almacenamiento

Cebador para secuenciación

Depende del equipo

A -20 °C en un congelador que no forme escarcha

BigDye®

Depende del equipo

A -20 °C en un congelador que no forme escarcha

Tampón de PPT de secuenciación

Depende del equipo

A -20 °C en un congelador que no forme escarcha


Nota: la mezcla con el terminador colorante es fotosensible y deberá protegerse de la luz mientras permanezca almacenado y cuando se esté utilizando.


2Materiales, reactivos y equipo no incluido:




2.1Termociclador de 96 pocillos con tapa térmica:

2.1.1Los equipos para secuenciación SeCore® se han probado en los siguientes termocicladores:


Tétrada del motor de ADN PTC 225 de MJ Research, Amplificador Genético 9600, Amplificador Genético 2700 y Amplificador Genético 9700 de Applied Biosystems.

2.2Secuenciador de ADN automático y accesorios:

2.2.1Los equipos para secuenciación SeCore® han sido probados con el secuenciador ABI Prism® 3100 de Applied Biosystems. El uso de otros secuenciadores de ADN necesita ser validado por cada usuario.

2.2.1.1Usuarios de ABI 3100: Matriz capilar 3100 de 36 cm para ABI 3100, código de producto de Applied Biosystems 4315931.

2.3Juego de dispositivo de retención/bandeja de 96 pocillos MicroAmp®, código de producto de Applied Biosystems 403081.

2.4Tubos de reacción de 0,2 ml, tubos de reacción (8 tubos/franja) y tapas (8 tapas/franja) MicroAmp®, códigos de producto de Applied Biosystems N801-0533, N801-0580 y N801-0535.

2.5Bandeja óptica de 96 pocillos y tapa de bandeja completa 9600 MicroAmp®, código de producto de Applied Biosystems N801-0560 y N801-0550.

2.6Centrifugador de sobremesa con adaptadores para bandejas de 96 pocillos. El centrifugador debe alcanzar una fuerza de 2.500 x g.

2.7Pipetas y puntas de pipetas: 1-10 µl, 10-200 µl, 100-1.000 µl.

2.8Pipetas electrónicas para dispensación: con capacidad para dispensar alícuotas de 1 a 125 µl.

2.9Pipetas multicanal (8 o 12 canales): volumen ajustable de 1 a 100 µl.

2.10Sistema CoolSafe de ajuste de tubos de 0,2 ml, código de producto de Diversified Biotech CSAF-1000.

2.11Reactivos para secuenciador capilar ABI 3100:




2.11.1 Polímero POP-6, código de producto de Applied Biosystems 4316357 . El uso de los polímeros POP-4 y POP-7 deberá ser validado por cada usuario.

2.11.2 Tampón para análisis genético 10X, código de producto de Applied Biosystems 402824.

2.11.3 Formamida Hi-Di™, código de producto de Applied Biosystems 4311320.

2.12Etanol absoluto, código de producto de Sigma Aldrich 270741-1L.

2.13Software del secuenciador:

2.13.1Para usar con ABI 3100.

  • Software de recogida de datos ABI Prism® v1.1 o superior (Win NT).

  • Software para análisis de secuencias v3.7 o superior (Win NT).

2.14 Software para análisis.

2.14.1Software uTYPE® SBT de Invitrogen, código de producto 539991 or 539992 (CE).




3Preparación de la muestra:




3.1Las amplificaciones de ADN genómico de locus específico purificadas con ExoSAP-IT™ a partir de los equipos para secuenciación SeCore® pueden utilizarse con este equipo.



Nota: los amplicones tratados con ExoSap-IT™ se pueden almacenar a –20 ºC hasta una semana.
Nota: Cambie las puntas de las pipetas en cada toma de muestra y mezclas o reactivos diferentes para evitar la contaminación cruzada. La misma punta de pipeta se puede utilizar para administrar la misma mezcla o reactivo en varios tubos, siempre que no entre en contacto con el ADN genómico o el producto de PCR. Si existe alguna duda al respecto, cambie la punta para evitar cualquier contaminación.

4Reacción de secuenciación:

4.1Preparación de las reacciones de secuenciación:

Nota: las mezclas de reacción de secuenciación se deben conservar tan frías como sea posible, utilizando el sistema CoolSafe recomendado o hielo.

4.1.1Para las muestras de clase II, si los amplicones tratados con ExoSap-It™ son utilizados, ellos han sido diluídos durante la secuenciación inicial, por lo tanto, no seran necesarias mas diluciones; pero si la muestra no fue diluída al comienzo, entonces diluya al doble el volumen del amplicón.




4.1.2Para las reacciones de clase I y clase II, añada al tubo o al pocillo correspondiente 2 µl de amplicones de PCR tratados con ExoSAP-IT™.

4.1.3Mezcle el contenido de los viales que contienen el terminador BigDye® y la mezcla del cebador para secuenciación.



Nota: después de mezclar, el vial con el cebador/ BigDye® deberá almacenarse a -20 ºC hasta la fecha de caducidad que consta en la etiqueta del equipo.

4.1.4Añada 8 µl de cada mezcla cebador de secuenciación/ BigDye® al tubo o pocillo correspondiente.

4.1.5Cubra los tubos o la bandeja, agite en vórtice brevemente hasta mezclar y centrifugue los tubos o la bandeja para llevar el líquido al fondo de los pocillos.

4.1.6Coloque los tubos o la bandeja en el termociclador y ejecute el perfil descrito en la sección 4.2.

4.2Perfil de secuenciación para las clases I y II:




Paso

Número de ciclos

Temperatura

Duración

Ciclo

25

95 °C

20 s

50 °C

15 s

60 °C

60 s

Remojo

1

4 °C

Infinita

La duración total de la reacción es ~1,5 horas.

5Precipitación en etanol de los productos de la reacción de secuenciación:

Después de la secuenciación, se realiza una precipitación de etanol para eliminar los terminadores sobrantes. Las instrucciones son similares para las reacciones de secuenciación de clase I y clase II.

5.1Añada 2 µl de tampón de PPT de secuenciación a cada mezcla de reacción de secuenciación.

5.2Centrifugue brevemente para asegurarse de que todo el contenido se mezcle y se deposite en el fondo del pocillo.

5.3Añada 40 µl de etanol al 100% a cada mezcla.

5.4Cubra la bandeja y agite bien en vórtice durante unos 60 segundos.

Nota: asegúrese de que el contenido de todos los tubos o pocillos está bien mezclado.

5.5Centrifugue la bandeja en un centrifugador provisto de un adaptador para bandejas durante 30 minutos a 2.000 g más.

5.6Retire la tapa, cúbrala con una toallita de papel y déle la vuelta. Centrifúguela por poco tiempo con la toallita de papel (< 1 min a 500 x g) en la posición invertida para eliminar la mayor cantidad de líquido posible.

5.7Añada 100 µl de etanol al 70% a los sedimentos de ADN. NO agite en vórtice la bandeja.

5.8Centrifugue la bandeja durante 5 minutos a 2.000 g o más.

5.9Elimine el sobrenadante mediante un giro invertido al igual que en el paso 8.6.

Nota: si se utilizan tubos independientes, centrifúguelos durante 15 minutos para la precipitación inicial y durante 5 minutos para el lavado a ~12.000 rpm. Elimine el sobrenadante mediante un breve giro invertido o por aspiración.

Nota: los sedimentos de ADN se pueden almacenar a –20 °C durante un máximo de 7 días.




6Electroforesis de los productos de la reacción de secuenciación.

6.1Preparación de las muestras que se van a cargar.

6.1.1Añada 15 µl de formamida Hi-Di™ (código de producto de Applied Biosystems 4311320) a cada sedimento de ADN.

Nota: si se utilizan tubos individuales hasta este paso, cambie las muestras a una bandeja óptica de 96 pocillos (código de producto de ABI N801-0560). Utilice la distribución de muestras propuesta en la sección 7.1.4.2.

6.1.2Cubra la bandeja y centrifúguela brevemente.

6.1.3Desnaturalice las muestras a 95 °C durante 2 minutos en un termociclador.

6.1.4Centrifugue brevemente para eliminar cualquier posible burbuja de aire de las muestras.

Nota: si las burbujas de aire se introducen en el dispositivo capilar, provocarán daños en el mismo.

6.1.5Coloque la bandeja en el inyector automático del secuenciador.

6.2Condiciones para la electroforesis en un secuenciador capilar ABI Prism® 3100.





Parámetros

Valores

Dye Set

E

Mobility File

KB_3100_POP6_BDTv1.mob

Basecaller

Kb.bcp

Run Module

RapidSeq36_POP6

Injection Time

10 seconds

Default Run Time

1800 seconds

7Análisis de los datos:




7.1Utilice el software para análisis de secuencias para procesar los datos sin procesar recopilados y crear archivos de secuencias.

7.2Utilice el software uTYPE® SBT de Invitrogen para procesar los ficheros de secuencias y crear un informe del HLA.



Nota: se recomienda encarecidamente aplicar la base de alelos más reciente de la base de datos IMGT/HLA del Instituto Europeo de Bioinformática (www.ebi.ac.uk/imgt/hla) para efectuar el análisis de los datos de secuencias por medio de uTYPE®.
Los datos generados a partir del equipo de GSSP se analizan conjuntamente con los datos originales del equipo para secuenciación SeCore® .

8Limitaciones y precauciones:

8.1Para garantizar un rendimiento óptimo de los equipos de GSSP SeCore® , utilice los productos con los materiales, reactivos y equipos recomendados en la sección 2 de este documento.

8.2El tipado de HLA con los equipos SeCore® para la secuenciación del HLA se debe realizar en presencia del director del laboratorio de HLA, un supervisor técnico u otro supervisor general, siguiendo los estándares oficiales de homologación de laboratorio aceptados (ASHI y EFI). Volvemos a hacer hincapié en que estos productos están destinados a un uso exclusivamente profesional.

8.3Los cebadores para los GSSP pueden detectar sitios polimórficos a partir de alelos a los que no se accedía. Algunos de los picos detectados a partir de alelos a los que no se accedía muestran generalmente amplitudes menores al 33% de los picos producidos por los alelos a los que se tenía acceso.

8.4La mejor alineación de los datos de secuenciación en la biblioteca se consigue con menos de 300 bases por secuencia.



8.5 Se recomienda que todos los resultados homozigóticos sean verificados por otro método.

9Solución de problemas:





Problemas

Causas posibles

Soluciones

Fondo excesivo (ruido de línea de referencia)

Matriz insuficiente o incorrecta

ABI 3100: Repita la calibración de espectro y vuelva a inyectar las muestras.

Inyección escasa (ABI 3100)

Vuelva a inyectar las muestras.

ABI 3100: Se ha establecido un tiempo de inyección demasiado largo.


ABI 3100: Reduzca el tiempo de inyección y vuelva a efectuar la inyección. Las potencias de señal comprendidas entre 300 y 3.000 son óptimas. (Es posible que las muestras de poca calidad presenten una potencia de señal inferior, aunque se pueden analizar y efectuar un tipado de ellas.).


Reacción de secuenciación insuficiente debido a un error de pipeta

Asegúrese de que tanto el producto de PCR tratado con ExoSAP-IT como la mezcla de secuenciación correspondiente se añaden y se combinan.

Se ha seleccionado un archivo de movilidad incorrecto; los picos aparecerán trasladados o superpuestos.

Seleccione el archivo de movilidad correcto.

Se ha añadido EtOH 100% en exceso.

Resecuenciación. Compruebe que la pipeta tiene el volumen correcto.

Señal débil

Las reacciones de secuenciación no se han agitado en vórtice correctamente tras la adición del tampón de PPT de secuenciación y EtOH.

Repita las reacciones de secuenciación. Agite en vórtice (de 50 a 60 segundos) tras la adición de EtOH. Asegúrese de que las reacciones están mezcladas.

Se debe aumentar el tiempo de inyección.

Repita las reacciones de secuenciación e incremente el tiempo de inyección.

Manchas de coloración excesivas

El tampón de PPT de secuenciación no se ha agregado a las reacciones de secuenciación antes de la adición de EtOH.

Repita la reacción de secuenciación. Añada el tampón de PPT de secuenciación antes que el EtOH.

Fallo al lavar las reacciones de secuenciación con EtOH 70%.

Repita las reacciones de secuenciación sin omitir el paso de lavado con EtOH 70%.

Reacción de secuenciación insuficiente debido a un error de pipeta o a un producto de amplificación poco consistente.

Asegúrese de que tanto el producto de PCR tratado con ExoSAP-IT como la mezcla de secuenciación correspondiente se añaden y se combinan. En caso de amplificación débil, confirme la intensidad del producto de amplificación utilizando gel de agarosa.

Fallo al eliminar los restos de EtOH durante la precipitación.

Repita las reacciones de secuenciación. El paso de centrifugado de 500 x g es muy importante a la hora de eliminar el etanol sobrante de los tubos de reacción.

El EtOH utilizado en el paso de lavado estaba demasiado diluido.

Repita las reacciones de secuenciación y confirme que se utiliza EtOH 70% en el paso de lavado.

Potencia de señal excesiva

ABI 3100: Se ha establecido un tiempo de inyección demasiado largo.


ABI 3100: Reduzca el tiempo de inyección y vuelva a efectuar la inyección. Las potencias de señal comprendidas entre 300 y 3.000 son óptimas. (Es posible que las muestras de poca calidad presenten una potencia de señal inferior, aunque se pueden analizar y efectuar un tipado de ellas.).


Fallos aleatorios de secuencia

Reacción de secuenciación insuficiente debido a un error de pipeta

Asegúrese de que tanto el producto de PCR tratado con ExoSAP-IT como la mezcla de secuenciación correspondiente se añaden y se combinan.


10Licencias y marcas comerciales



AVISO AL COMPRADOR; LICENCIA LIMITADA

Toda licencia sujeta a las reivindicaciones sobre procesos de las Patentes estadounidenses: 151.507;5.171.534; 5.332.666; 5.242.796; 5.306.618; 5.366.860; 5.821.058 y/o de sus correspondientes extranjeras, tiene un componente de tarifa por adelantado y un componente de pago recurrente. El precio de compra de este equipo incluye derechos limitados no transferibles dentro del componente de pago recurrente para usar solo esta cantidad del producto para llevar a cabo el proceso de secuenciación del ADN descrito en las citadas patentes cuando este producto se utilice junto con un instrumento de Análisis de Secuencia de ADN Autorizado cuya utilización esté cubierta por el componente de tarifa por adelantado de estas patentes. No se otorga ningún otro derecho de manera expresa, por implicación, o por preclusión, o bajo ningún otro derecho de patente propiedad de Life Technologies Corporation (Invitrogen Corporation) o susceptible de ser entregado como licencia por esta empresa.

Para obtener más información sobre la compra de licencias para la realización de la secuenciación de ADN, pueden ponerse en contacto con el Director de Licencias de Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way Carlsbad CA 92008 EE. UU.

AVISO AL COMPRADOR; LICENCIA LIMITADA

El precio de compra de este equipo incluye una licencia de derecho limitado, no transferible, no exclusiva (sin derecho de reventa, reembalaje, o sub-licencia) dentro del proceso de solicitud de una o más de las Patentes estadounidenses 5.800.996, 5.863.727, y 5.945.526, y las reivindicaciones correspondientes en patentes y solicitudes de patentes extranjeras homólogas, para utilizar este producto únicamente con una máquina de secuenciación de ADN automatizada comercial de Life Technologies (Applied Biosystems LLC) que haya sido autorizada dentro de estas patentes por Life Technologies. Por la presente, no se otorga ninguna licencia para el uso de este equipo ni de los reactivos contenidos en cualquier otra máquina de secuenciación automática. Para obtener información relativa a la disponibilidad de licencias adicionales para la práctica de las metodologías patentadas, pueden ponerse en contacto con: Director de Licencias, Life Technologies Corporation, 5791 Van Allen Way Carlsbad CA 92008 EE. UU.

AVISO AL COMPRADOR: SOBRE LA LICENCIA LIMITADA
Este equipo también se vende de conformidad con una sub-licencia limitada de Amersham International plc bajo una o más patentes estadounidenses con los números 5.498.523 y 5.614.365; y sus correspondientes patentes extranjeras y solicitudes de patentes. La compra de este equipo incluye una sub-licencia limitada no exclusiva (sin derecho de reventa, reembalaje, o sub-licencia) dentro de los derechos de esas patentes para usar este reactivo para la secuenciación del ADN únicamente con una máquina comercial automática de Secuenciación de ADN de Life Technologies (Applied Biosystems LLC). Por la presente, no se otorga ninguna licencia para el uso de este equipo ni de los reactivos contenidos en cualquier otra máquina de secuenciación automática. No se concede ninguna otra licencia de manera explícita, implícita o por preclusión. Para obtener información sobre la disponibilidad de licencias adicionales para la práctica de las metodologías patentadas, pueden ponerse en contacto con: Director de Licencias de Life Technologies Corporation

Marcas comerciales

SeCore es una marca comercial registrada de Life Technologies Corporation

Invitrogen es una marca comercial de Life Technologies Corporation

ABI PRISM, Applied Biosystems, BigDye son marcas comerciales registradas de Applied Biosystems LLC o sus filiales en Estados Unidos y otros países.

FastStart es una marca comercial de Roche Molecular Biochemicals.

ExoSap-IT es una marca comercial de USB Corporation

uTYPE es una marca comercial registrada de Life Technologies Corporation

Las demás marcas comerciales son propiedad exclusiva de sus respectivos propietarios.
PR043S

Revisión 06

Impreso el 6/09


Representante en Europa:

Invitrogen Ltd.

11 Bassendale Road

Croft Business Park

Bromborough, Wirral

CH62 3QL, U.K.

Tel: 44 151 346 1234










Invitrogen Corporation

9099 North Deerbrook Trail

Brown Deer, Wisconsin 53223, USA

Tel: (800) 955-6288

Fax: (800) 331-2286

www.invitrogen.com




Para obtener los datos de contacto específicos de cada país, visite nuestro sitio web en

www.invitrogen.com



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9099 N. Deerbrook Trail

Brown Deer, Wisconsin 53223, USA

Tel. 1-800-955-6288

Fax 1-800-331-2286

Email: catalog@invitrogen.com



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