El aislamiento de genes específicos de cromosomas eucarióticos es un proceso muy difícil y lento, para el cual se conocen dos métodos principales: Método forzado (shotgun) y obtención de adn complementario (adnc) a partir del arnm del gen. Método forzado (shotgun)
descargar 159.35 Kb.
|
Ingeniería Genética Producción intencionada de nuevos genes y alteración de genomas, mediante la sustitución o adición de material genético nuevo. La ingeniería genética es un campo de la ciencia que se dedica a investigar la posibilidad de recombinar artificialmente genes o grupos de genes para producir nuevas combinaciones que no aparecen biológicamente. Por ejemplo, es posible aislar genes que especifican dos proteínas diferentes a partir de dos especies distintas de organismos, y unirlos entre sí para dar lugar a una nueva combinación. Los ADNs resultantes, llamados recombinantes, son instrumentos extraordinariamente útiles en la investigación genética. También pueden tener una utilidad práctica, con aplicaciones importantes en medicina y agricultura. La complejidad de los genomas eucarióticos hace que el estudio de un gen y de su expresión sea muy difícil. Las técnicas de recombinación permiten actualmente el estudio de un gen aislado y amplificado mediante su transplante a un sistema bacteriano. Las posibilidades de conseguir un beneficio práctico son numerosas. Por ejemplo, la inserción en bacterias de un gen sintético que codifica la hormona somatostatina induce a aquellas a la producción de la hormona, es decir, que el gen sintético se puede replicar, transcribir y traducir por el huésped. Además, las técnicas recombinantes pueden ser adaptadas para la síntesis de vacuna: (la vacuna de la hepatitis B está siendo obtenida por ingeniería genética, introduciendo en levaduras el fragmento de ADN que codifica para las proteínas de la superficie viral). De la misma manera, el gen que codifica la proinsulina humana se ha recombinado adecuadamente y se ha hecho reproducir en E. coli. El resultado es que la bacteria produce proinsulina. Actualmente, se están consiguiendo muchos logros en ingeniería genética. La potencialidad de las tecnologías de ADN recombinante para obtener beneficios es enorme. Aislamiento de genes y preparación de ADN complementario El aislamiento de genes específicos de cromosomas eucarióticos es un proceso muy difícil y lento, para el cual se conocen dos métodos principales: Método forzado (shotgun) y obtención de ADN complementario (ADNc) a partir del ARNm del gen. Método forzado (shotgun) De aislamiento de genes y preparación de ADN complementario: el ADN celular se trata con una enzima de restricción de las que producen extremos escalonados. Después los fragmentos de ADN resultantes se unen en los plásmidos de E. coli abiertos con la misma endonucleasa de restricción. El ADNc se inserta en un plásmido o en un vector viral. Si el ADNc ha de incorporarse a un plásmido, se le debe proveer de "colas" o extremos cohesivos apropiados. Eso se consigue añadiendo a los extremos 3' opuestos de las dos hebras del ADN doble, una serie de residuos desoxirribonucleotídicos repetidos de la misma clase, por ejemplo residuos A, gracias a una transferasa terminal. Seguidamente, el plásmido experimenta una apertura en un solo punto, dando lugar a su forma lineal, por acción de una endonucleasa de restricción que produce extremos nivelados. Luego, se añaden colas de poli T a los extremos 3' del plásmido lineal, complementarias de las colas del ADNc . Se mezclan el plásmido lineal y el ADNc y se deja que se apareen. Entre los productos obtenidos se encuentra un plásmido circular agrandado que contiene el nuevo gen. A continuación se forman los enlaces covalentes por adición de ADN ligasa. Transformación. - Esta etapa consiste en introducir la molécula de ADN recombinante (el inserto y el vector unidos) en una célula hospedadora, donde puede ser replicado; por ejemplo, la inserción de plásmidos en el cromóforo de E. coli. Los plásmidos recombinados se mezclan con las bacterias. La colonia o clon de bacterias de E. coli que adquiere el plásmido recombinado se deja crecer durante muchas generaciones a gran escala, lo que incrementa el número de plásmidos recombinados. De esta forma se ha realizado un clonado de un determinado gen, es decir, la formación de muchas copias idénticas que se replican a partir de un solo gen introducido en una célula huésped. El ADN recombinado, portador de genes procedentes de dos especies distintas, se denomina ADN quimérico. Las bacterias que poseen el nuevo gen son capaces de expresarlo en forma de proteínas que son vertidas al medio de cultivo, de donde se pueden recuperar sin dificultad para su uso. Bibliotecas de ADN. Los procesos de clonaje molecular y aislamiento de estos fragmentos se inician con la construcción de una biblioteca de ADN o un banco de ADN. Éstas están formadas por todas las moléculas de plásmidos o fagos recombinantes originados al unir un ADN a un vector. Las bibliotecas deben cumplir la característica de poder introducirse en células donde cada recombinante pueda replicarse in vivo. Existen varios tipos de bibliotecas en función de la naturaleza de las moléculas utilizadas y del tipo de estudio científico que se quiera realizar. Así por ejemplo, las bibliotecas del ADN del genoma se construyen mediante el clonaje de todo el ADN del genoma de un organismo. Las bibliotecas de ADNc son un tipo de bibliotecas de ADN, muy utilizadas para el estudio de genes eucarióticos que codifican proteínas. Además, son más sencillas y ventajosas que las bibliotecas genómicas, ya que se obtienen de ARNm maduros y, por tanto, no contienen intrones ni secuencias que flanquean a los genes. Éste es un dato importante, al tener en cuenta que los hospedadores procarióticos, como las bacterias, carecen de una maquinaria para el procesamiento del ARN. Los clones de ADNc permiten el estudio de las distintas poblaciones de moléculas de ARNm que se encuentran en diferentes tipos celulares. Las bibliotecas de ADN deben ser grandes para ser útiles, y la probabilidad de encontrar una secuencia determinada de un genoma depende de varios factores, entre ellos el tamaño de los insertos, el tamaño del genoma y la abundancia del ARNm que interese. Aplicaciones de la ingeniería genética. - Actualmente, se presta mucha atención a los posibles usos prácticos del ADN recombinado. En general, existe entre la población un cierto "miedo" a los experimentos genéticos. Pero hay que decir que el clonado de genes y su expresión en forma de productos proteicos por células de E. coli o de levaduras hace posible la producción comercial de muchas proteínas de utilidad práctica que, de otro modo, son muy difíciles de obtener en abundancia. Los genes de algunas proteínas necesarias en medicina han sido clonados. La insulina, que se obtenía a partir de páncreas de cerdo, se puede hoy obtener de cultivos bacterianos que contienen el gen humano clonado, con lo cual proporcionan una insulina con la misma secuencia de aminoácidos que la humana, cosa que no ocurría con la insulina porcina. La insulina obtenida en E. Coli se utiliza actualmente en el tratamiento de la diabetes mellitus. Igualmente ocurre con la hormona de crecimiento (somatotropina) que se administra a pacientes que padecen enanismo. Los interferones, agentes antivirales naturales y potenciales anticancerígenos, pueden aislarse a partir de leucocitos de la sangre, pero el rendimiento es de tan solo 1 microgramo por litro, y por ello son productos muy caros. Los genes de los interferones pueden ser clonados y expresados en bacterias, que crecen con facilidad y producen interferón en grandes cantidades. También podrían producirse en gran cantidad varias proteínas de utilidad en agricultura. La incorporación de los genes de las enzimas y de otras proteínas, que participan en la fijación de nitrógeno en los genomas de las plantas de cultivo que normalmente no fijan el elemento, podría tener un éxito mundial absoluto. Modificación genética en bacterias. - Las bacterias son capaces de adaptarse a cambios de temperatura, presión o nutrientes del medio, gracias al desarrollo de nuevos procesos metabólicos y productos génicos que les confieren resistencia para vivir en esas condiciones. Estos cambios suelen producirse en los plásmidos bacterianos, los cuales se pueden aislar e introducir en otras bacterias que asimilarán estas nuevas propiedades. Mediante la ingeniería genética y la utilización de plásmidos bacterianos, los científicos pueden construir nuevas bacterias para un determinado fin. Es el caso de los trabajos realizados por Ken Timmis y sus colaboradores, en los que mediante la utilización de técnicas de recombinación del ADN, han conseguido combinar las enzimas claves de cinco rutas distintas de degradación de compuestos contaminantes del medio ambiente, pertenecientes a tres bacterias diferentes (Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. B13 y Alcaligenes eutrophus), para originar una nueva bacteria desarrollada sobre mezclas letales de ciertos compuestos (Clorobencenos, tolueno, clorofenoles y xileno). La ruta metabólica resultante es estable y regulada en respuesta a la presencia de ciertos compuestos aromáticos. Modificación genética en plantas. - Las plantas han sido siempre objeto de estudio, con el fin de mejorar sus características y obtener cultivos que permitan una mejora en la alimentación y en la ornamentación. Uno de los grandes avances en la biología molecular de las plantas se ha conseguido mediante la utilización de un plásmido bacteriano perteneciente a la bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens. El plásmido Ti, así denominado, puede transformar una gran variedad de plantas. El ADN transformante del plásmido Ti se llama T-ADN y puede subclonarse en un vector compatible con la bacteria E. coli, dando lugar a la formación de vectores transbordadores planta-E. coli. Los vectores transbordadores son plásmidos vectores que pueden transformarse tanto en células procarióticas como eucarióticas. En este caso, el plásmido recombinante pueden transformar células de A. tumefaciens y, cuando la bacteria infecta a una planta, transfiere el T-DNA, que se inserta en el genoma de la célula y por tanto puede ser expresado por la maquinaria genética de dicha célula. Aunque la inserción solo haya tenido lugar en una célula, el gen puede heredarse gracias a que muchas plantas pueden regenerarse a partir de tejidos diferenciados, que pueden haber sido infectados. Estos organismos donde se produce la integración estable de genes extraños se denominan organismos transgénicos. La tecnología del clonaje del T-ADN es utilizada para conseguir cultivos con mayores ventajas nutritivas, así como para transmitir al genoma de muchas plantas genes implicados en la resistencia a herbicidas, con la ventaja de que no se producen daños en el medio ambiente. La investigación está principalmente dirigida a la posible introducción de genes extraños de plantas resistentes o de origen bacteriano, cuya expresión origine proteínas capaces de catabolizar dicho herbicida. Actualmente, también se investiga la posibilidad de que plantas no leguminosas, como el trigo y el maíz, realicen la fijación bacteriana del nitrógeno, fenómeno de gran importancia para la producción de alimentos. Modificación genética en animales. - La manipulación genética y las técnicas de clonaje molecular constituyen procesos y herramientas muy utilizados en la investigación básica, como demuestran los siguientes estudios: La introducción de un gen humano o de ratón en la mosca del vinagre (Drosophila melanogaster) permitiría demostrar que los procesos genéticos que controlan el desarrollo embrionario de las diferentes especies son muy similares; las formas corporales de todos los animales se definen por mecanismos casi idénticos, y estos mecanismos están dirigidos por un grupo de genes relacionados entre sí, genes HOM en invertebrados y genes Hox en vertebrados. Teóricamente, la sustitución de un gen HOM de una mosca por su homólogo Hox permitiría que éste se expresara cuando y donde lo hubiera hecho el gen HOM; sin embargo, la técnica actual no nos permite manipular genes enteros, por lo que solo se han utilizado secuencias de ADN de Hox unidas a elementos reguladores inducibles por calor. Con este experimento se ha conseguido que todas las células de una mosca en desarrollo expresaran una proteína Hox. Además, una de esas proteínas es la HOXD4 humana y se sabe que el gen que la codifica tiene un homeodominio semejante al de la proteína Deformded de la mosca. Cuando el gen Deformed de Drosophila se expresa fuera de sus límites normales provoca anomalías cefálicas, y sorprendentemente, la expresión de la proteína humana en las células de la mosca en desarrollo causa las mismas deformidades; aunque este resultado puede ser debido a que la proteína humana active la expresión del gen Deformed en la mosca, siendo éste uno de los efectos de la propia proteína Deformed. Terapia génica. - Otra línea de investigación muy interesante en la biología de mamíferos es la llevada a cabo por una nueva técnica que permite crear ratones portadores de mutaciones controladas de cualquier gen conocido. El proceso mediante el cual se introducen cambios específicos en la secuencia de nucleótidos de un gen se denomina sustitución dirigida de genes (gene targeting), y con ella se pretende conseguir información sobre las etapas del desarrollo embrionario humano, la constitución de nuestro sistema inmunitario, el funcionamiento del cerebro y la forma en que ciertos defectos génicos se traducen en enfermedad. Existen más de 5.000 enfermedades humanas, entre ellas el cáncer, atribuidas a defectos genéticos; la identificación de los genes y las mutaciones responsables de esas enfermedades permitiría conseguir las mismas mutaciones en ratones (por sustitución dirigida de genes). Esto permitiría estudiar con más claridad los procesos que ocurren entre el funcionamiento anómalo de un gen y la manifestación de la enfermedad. El mejor conocimiento de la patología molecular de la enfermedad ofrecerá la posibilidad de elaborar terapias más eficaces, sobre todo las dirigidas a corregir defectos. Actualmente, la terapia consiste en la inserción aleatoria de genes sanos en los cromosomas, pero éstos no funcionan con la misma eficacia que los que ocupan su lugar correcto en el cromosoma. Diseño de fármacos por ingeniería genética. - Mediante la tecnología del ADN recombinante se producen actualmente grandes cantidades de productos génicos terapéuticos a partir de genes clonados, tales como insulina, interferones, interleuquinas y hormonas del crecimiento. Además, gracias a los procedimientos de clonaje, expresión y purificación, se trata de identificar la proteína clave en un proceso patológico, aislarla en grandes cantidades, determinar su estructura tridimensional mediante cristalografía de rayos X, y finalmente diseñar moléculas que inhiban su función. Actualmente, los fármacos que se utilizan son poco selectivos y actúan por igual en todas las especies, con lo cual resultan tóxicos para el agente patógeno pero también para el hospedador. Uno de los principales objetivos de la biotecnología es el desarrollo de fármacos, cuya acción sea más selectiva sobre determinadas especies. (Véase biotecnología). Uno de estos casos es la enfermedad del SIDA, en la que se investiga para desarrollar fármacos selectivos contra el virus que la produce. Actualmente, se han identificado dos proteínas claves propias del virus: una proteasa y una transcriptasa inversa; mediante ingeniería genética se consigue una elevada producción de estas proteínas en E. coli, y se está investigando profundamente estas proteínas para obtener fármacos más efectivos y específicos, con la ayuda de métodos cristalográficos y de diseños de fármacos que funcionen como potentes inhibidores. Proyecto Genoma Humano. - Es un proyecto coordinado por numerosas instituciones, que se inició en 1990 con el fin de obtener el genoma humano completo. El genoma humano será, en un futuro, cartografiado y totalmente secuenciado, de forma que se clonará y se construirá un mapa de cada cromosoma humano. Mediante el empleo de endonucleasas de restricción se cortan los clones y se obtienen los mapas de clones contiguos. Los datos obtenidos acerca del tamaño de los fragmentos de restricción de cada clon se introducen en un ordenador, que compara esos tamaños en todos los clones analizados y determina qué clones presentan sitios de restricción comunes, por lo que dichos clones pueden ordenarse según este criterio. Los mapas que se obtengan serán de gran valor en investigaciones acerca de la organización génica y cromosómica, así como en la identificación de genes implicados en ciertas enfermedades genéticas. |
