GE02: Genética molecular organización, regulación y manipulación Dr. Sequeira Genética molecular organización, regulación y manipulación




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fecha de publicación01.08.2016
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GE02: Genética molecular organización, regulación y manipulación


Dr. Sequeira

Genética molecular organización, regulación y manipulación

Dr. Sequiera

Viernes 7 de agosto. 1pm

Organización del genoma


Esta clase es sobre la organización del genoma, es decir, como se organizan las bases nitrogenadas, los nucleótidos, las secuencias en los genomas. Un genoma es todo el material genético de una célula (todo el ADN por célula o por organismo) y que es característico para esa especie.

Entonces la pregunta es: ¿cómo está organizado el genoma, se encuentran las bases en patrones o distribuido al azar? Distribuido al azar significa que cada uno de los cuatro nucleótidos tenga la misma probabilidad de estar en una posición, es decir en la primera posición cualquiera de los cuatro nucleótidos tiene un 0,25 de probabilidad de estar, en la siguiente posición cualquiera 0,25 y así por los 1000 millones de pares de bases. En caso de un patrón entonces ya esa probabilidad no seria 0,25 porque si todos los genomas empezaran con AG y es necesario que iniciaran con AG, entonces ya ahí no hay una probabilidad de 0,25 sino que es un patrón. Los nucleótidos generalmente no están distribuidos al azar, sino que presenta un patrón es decir una secuencia reconocida.

Entonces, con el proyecto genoma humano, en cual comenzó en 1990 y terminó en el 2003. Este proyecto trae una serie de datos, información y fenómenos con respecto al genoma que en realidad no fueron nuevos en el momento en el que se finalizó el proyecto debido a que a lo largo del proceso de secuenciación del ser humano se secuenciaron muchos otros genomas de organismos modelos utilizados en investigación. Por esto cuando se publicó la secuencia del genoma humano ya se conocían el genoma del ratón y otros organismo, en los cuales se había visto un patrón especifico a lo largo de diferentes grupos filogenéticos.

Entonces cuando se tiene la secuencia del genoma humano se obtiene esto:



Figura 1. Organización del genoma humano y su distribución de secuencias.

Entonces en la distribución de secuencias en el genoma las secuencias que codifican para proteínas representan solo un 1,5 % del genoma, esto lleva a la pregunta de ¿qué hace todo lo demás?, durante mucho tiempo al resto del genoma se le llamo ADN basura pero actualmente se sabe que tiene función.

En la caracterización de la secuencias del genoma humano solo 1,5 % codifica para proteínas del resto una gran mayoría está compuesto por ADN repetitivo. El ADN repetitivo tiene diferentes orígenes, pero se puede simplificar como orígenes virales, es decir, genomas virales que fueron integrados al genoma humano, que perdieron sus características virales y que se mantuvieron ahí. Entre estos tenemos secuencias como:

  • LINE’s (elementos intercalados largos) que se derivan de retrotrasnposones.

  • SNE’s (elementos intercalados cortos) que derivan de transposones

  • Retrotransposones LTR (long terminal repeats , repeticiones terminales largas)

  • Transpososnes ADN

Otras secuenciias repetitivas

  • Secuencias repetitivas simples

  • Duplicacion de segmentos

Esto representa casi un 50% del genoma humano derivado de secuencias ancestrales virales. Todo eso es en esencia ADN repetitivo, sin embargo, existen otras secuencias que también son ADN repetitivo por ejemplo secuencias repetidas simples, duplicaciones de segmentos, heterocromatina miscelánea (el termino misceláneo se refiere a de diferente origen o tipo, gran parte de la heterocromatina es ADN repetitivo). Por esto tenemos que el genoma humano puede estar compuesto hasta en un 78% de secuencias repetitivas.

Tambien el genoma incluye la heterocromatina miscelánea, que es una heterocromatina que está conformada por diversos tipos de secuencias; secuencias únicas misceláneas e intrones.

Los porcentajes respecto a la distribución del genoma varia un poco dependiendo de la literatura utilizada. En la figura uno la gráfica de la izquierda es un poco más reciente que la otra y toma en cuenta ADN regulatorio, genes para ARN´s no codificantes entre otros, pero si se comparan ambas en términos generales son muy similares. Es evidente que a lo largo del tiempo se debe dar una diferenciación porque se van produciendo funciones nuevas de secuencias nuevas entonces se actualiza.

Ese más del 50% del ADN de origen viral a lo largo de la historia evolutiva perdió sus características virales, es decir, si eran transposones o retrotrasnpososnes ya no se comportan como tal en la secuencia, sus características se perdieron y se mantuvieron silenciados en el genoma. Sin embargo cuando se tuvieron los primeros datos del genoma humano se debe replantear el dogma central de la biología. Debido a esto se fundó el proyecto ENCODE (por su nombre es enciclopedia de elementos de ADN) que lo que pretende es caracterizar funcionalmente todas las secuencias que hay en el genoma. Este proyecto se inició en el 2003 y los primeros resultados se publicaron el en 2006-07 según los cuales cerca del 93% del genoma se trascribe, es decir, si tenemos solo un 1,5% que es ADN codificante (menor al 5 o 2,5% depende de los estudios), que hace todo lo demás que se transcribe. EN un segundo reporte del 2013 se determina la función para en 80% de este 93, que muchas veces es teórico (por bioinformática), pero se debe todavía corroborar experimentalmente. La mayoría de este 80% tiene su función en los procesos de regulación, por esto se creé que es la regulación la que determina la complejidad de los seres biológicos (antes se creía que la complejidad está determinada por el número de genes). Hace un par de meses de presentó una comparación entre el genoma del ratón y el del ser humano, los dos genomas tiene la misma cantidad de pares de bases, de genes y los genes son básicamente idénticos y una secuencia con una similitud de un 95%; entonces se considera que la regulación es la que da la diferencia entre las dos especies.

ADN repetitivo


Es la gran mayoría del genoma (hasta un 68%) y se define como una secuencia de ADN que se repite en bloque variable. Cuando la misma secuencia se repite una y otra vez sin interrupciones (seguidas) se les denomina repeticiones en tándem. También hay secuencias que se repiten y tiene interrupciones. En muchos casos las secuencias repetitivas están dispersas en a lo largo de todo el genoma.

El ADN repetitivo es muy importante para distintos análisis, estudios de variabilidad genética, ejemplo los estudios de paternidad se basan en estas secuencias entonces se usan para saber si una molécula de ADN viene de otra molécula de ADN.

Figura 2. Clasificación del ADN repetitivo.

Clasificación del ADN repetitivo


La diferencia entre el ADN altamente repetitivo y el medianamente repetitivo es solo el número de repeticiones.

Los genes en copias múltiples son genes que a lo largo de la evolución se han ido duplicando de forma que en el genoma tenemos regiones con muchos genes, por ejemplo los genes de ARN ribosomal. Nucléolo: es una parte del núcleo de células eucariotas (punto físico de la célula); en la cual, se aglomera ADN que tiene los genes de ARN Ribosomal. Su importancia es debido a la producción de proteínas en los ribosomas. Aproximadamente son 400 genes distribuidos en 5 cromosomas en closters de genes (genes que se agrupan o están juntos uno detrás del otro).
  1. Altamente repetitivo-ADN satelitico


Se llama ADN satelitico porque en diferentes estudios para determinar la composición de los genomas se encontraban en los primeros análisis dos picos o bandas distintas con electroforesis, entonces se formaba un pico o banda principal y un pico o banda más pequeña que correspondía al ADN altamente repetitivo y por eso se le llamo ADN satelitico.

El ADN altamente repetitivo se encuentra básicamente en el centrómero (región con más secuencias repetitivas, relacionado a que tiene que estar altamente compactado) y regiones pericentromericas (a cada lado del centrómero). Además en los telómeros (los cuales son secuencias altamente repetitivas, que permitían la formación de los cuartetos g) y subtelómericas.

Los cuartetos g eran las repeticiones que llevaban a conformaciones especiales que son una especie de nudos que protegían los telómeros.


  1. ADN medianamente repetitivo

  • Microsatelite (STR)


Son secuencias repetitivas de ADN; en dónde; los bloques tienen entre 5-10 pares de bases que se repiten en tándem.

Los números de pares de bases varían dependiendo de la literatura, pero son importantes los que se encuentran en la transcripción. (En la imagen de la presentación vienen otros valores).

STR: short time repeats

VNTR: variable time repeats
  • Minisatelites (VNTR)


Son secuencias repetitivas de ADN; en dónde; los bloques tienen entre 10-100 pares de bases que se repiten en tándem.
  • SINE’s


Son secuencias de origen transposónico. Son elementos nucleares intercalados que se conforma por menos de 500 pares de bases que se encuentran dispersos en el genoma (se pueden encontrar hasta 500000 veces).
  • LINE’s


Son de origen retrotransposonico. Son elementos nucleares intercalados que se conforma por menos de 6000 pares de bases que se encuentran dispersos en el genoma (se pueden encontrar hasta 850000 veces).

Transposones y retrotransposones


Son llamados genes saltarines.

Transposones:

Es una secuencia de origen viral que colonizó una genoma, se introdujo en el genoma y puede ser transcribirle y traducible y lleva a la síntesis de una proteína. Esta proteína puede cortar la secuencia e insertarla en otro sitio. En el caso de que este gen se inserte en otro gen puede producir una mutación y silenciar el gen.

Retrotransposones:
Esta secuencia es transcrita, traducida y lleva a la síntesis de una proteína pero esta proteína no actúa a nivel de ADN sino que es una transcriptasa reversa, es decir, utiliza ARN como molde para la síntesis de ADN. Utiliza el ARN que le dio origen y sintetiza una hebra de ADN y la otra hebra de ADN y esto eventualmente este llevado a otra parte del genoma e insertado. Pasa lo mismo que con el transposon entrando en medio de genes eliminado o alterando función.


Pseudogenes




Se define como un gen falso, que se asocia al gen al cual se dio origen. Surgió por medio de la duplicación génica que se desencadeno por un proceso mutacional en donde un gen se duplicó generando 2 copias de un mismo gen; en donde, al haber un gen funcional, el otro gen esté a la libre y acumula mutaciones hasta ser no funcional.

Tener dos genes del mismo tipo puede traer problemas e incluso asociarse con enfermedades. AL tener dos genes uno mantiene la función en tanto que el otro puede ir acumulando mutaciones debido a que no presenta una presión de selección (presión por que se mantenga igual o cambie a variantes positivas). Se creee que este gen se silencdia y es un gen que no tiene función. Sin embargo actualmente se sabe que estos genes tienen algún tipo de función reguladora pero está en estudio.

Se cree que esta es la forma en la que aparecen las familias génicas, es decir, genes que están relacionados por función pero son variables. Son genes o familias generadas por duplicación que podemos diferenciar a lo largo del tiempo.

Algunas generalidades del genoma humano




El profesor leyó toda la información del cuadro y dijo que era variable lo que decía en el mismo y que era importante. Las últimas tres no son importantes.

Regulación de la expresión génica


Los genomas se expresan, los genes se expresan independientemente que sean para proteínas o sea ADN no codificante y esta expresión es regulada. La regulación implica control y un gen debe ser controlado porque la expresión de los genes se adapta a las necesidades de las células, entonces cualquier señal intrínseca o extrínseca que determine un cambio en las necesidades de la célula puede llevar a cambios en la expresión de los genes. Cuando se habla de cambios de regulación nos referimos a señales que le “dicen” a la célula necesito esto, necesito menos de esto, necesito que este proceso termine o se inicie. Entonces regulación implica control, implica adaptar las condiciones de un sistema dependiendo de las características de este sistema.

La regulación es sumamente importante porque es lo que le permite a la célula sobrevivir, responder y adaptarse. Para ejemplificar la importancia de la regulación: una neurona, una célula de musculo esquelético y un linfocito de un solo individuo tiene el mismo genoma pero lo que define sus diferencias es la regulación de genes. También a lo largo del desarrollo tenemos las células madre pluripotencial es una célula no diferenciada que puede dar origen a cualquier líneas celulares. Estas células tienen un genoma y necesitan de la expresión de factores pluripotenciales para mantenerse en este estado y a lo largo del desarrollo reciben una serie de señales distintas y llevar a patrones de expresión de genes distintos y esto en última estancia nos lleva a una muy amplia variedad de células que tiene un gripo de genes que se expresan en todas y otro grupo de genes que se expresan específicamente.


La expresión génica




Figura de repaso de la semana anterior. Es una imagen importante.

Regulación de la Expresión Génica


Los procesos que suceden en la célula son regulables en todos los niveles, desde la transcripción hasta la proteína activa, los cuales son:

  • Control transcripcional

    • Este es el punto de control más importante de la regulación génica y es principalmente al inicio de la transcripción.

  • Control de procesamiento de ARN.

    • Ejemplo del splicing alternativo

  • Control del transporte y de la localización del ARN

    • Ejemplo los ARN que salen del citoplasma son llevados al ribosoma pero en muchísimos casos los ARNs se agrupan con otras proteínas en lo que se llaman complejos ribonucleicos y van a sitios específicos de la célula a ser traducidos en este sitio donde se ocupa una alta concentración de esta proteína por ejemplo en el botón sináptico.

  • Control de la degradación del ARNm

  • Control de translocación

  • Control de la actividad proteica

Es frecuente en la célula que se transcriban muchos genes pero el ARN sea degradado de una vez porque la célula no necesita la proteína en ese momento pero cuando se active una señal puede usar ese ARN que se encuentra en formación constante.


Regulación transcripcional: sitios de reconocimiento en promotor y FT’s


FT: factores de transcripción.

A nivel de la transcripción se debe tomar en cuenta lo de los territorios cromosómicos, entonces para que suceda el proceso de transcripción los genes tienen que ser llevados a las fábricas de transcripción desde sus puntos específicos en los territorios cromosómicos.

A nivel del inicio de la transcripción esta es regulada por factores de transcripción entonces algunos FT llegan al núcleo y otros son más bien sacados del núcleo, y todo esto depende del ambiente de cromatina en el que se encuentre. Esto se va a tratar en la clase de epigenética. Se da un estímulo para la expresión de un gen entonces se activa una serie de FT que se van a unir al promotor. El promotor es más complejo de lo que se ha discutido con anterioridad porque presenta un montón de sitios de reconocimiento para los diversos FT y a fin de cuentas el resultado final en la activación o el silenciamiento de los genes va a depender de quienes se están pegando a que sitio de reconocimiento. Por lo tanto lo importante es la combinación de los FT y no tanto de un u otro FT; estos define si se expresa y el grado de expresión del mismo. Entonces a nivel de inicio lo importante es la combinación de FT, un mismo FT puede ser activador o silenciador dependiendo de los otros FT. El complejo de preiniciación siempre está ahí, lo que varían son los FT y depende de la combinación de los mismo depende el efecto final que van a generar. Aumenta o disminuyen afinidad, especificidad o eficiencia.



Figura básica para el examen.

EJEMPLO: CREB y los elementos CRE según TRED. CREB reconoce CRE pareo una secuencia no es específica.


CREB proteína de unión al elemento de respuesta del AMPciclico. Entonces CREB es una FT que reconoce una secuencia en el ADN CRE. Esta secuencia en el ADN CRE no es especifica (única) hasta el momento existen 41 secuencias reportadas a las cuales se puede unir el CREB. Esto tiene un efecto sobre el inicio de la transcripción esto porque si la secuencia es más o menos específica entonces el FT puede interactuar de forma más o menos específica con otros FT. Esto tiene una relevancia funcional pero también a nivel genómico. La importancia genómica es que pueden existir distintas secuencia relacionadas lo que permite que la presión de selección para que estas secuencias surgan a lo largo del genoma sea menor, entonces básicamente el mismo factor de transcripción puede regular a más genes porque se puede unir a distintas secuencias. Por ejemplo el CRE regula 150 genes activándolos o inactivándolos.

Otros elementos en cis


  • Potenciadores y silenciadores:

Un elemento en cis se define como secuencias presentes en el ADN. Todas las secuencias de reconocimiento de promotores se encuentran en cis. Además de secuencias promotoras, existe los potenciadores y los silenciadores. Mientras tanto los elementos en trans son los que se le unen al ADN, como por ejemplo las proteínas que reconocen los promotores.

Los potenciadores y silenciadores son secuencias de ADN que existen corriente arriba o corriente abajo de la secuencia que se va a transcribir, estas secuencias pueden estar muy alejadas o muy cercanas a la secuencia que se va a transcribir.

En el caso de los potenciadores, al ser reconocidos por una proteína van a tener un efecto activador de la transcripción. Como lo dice su nombre, los silenciadores al ser reconocidos por una proteína se encargan de silenciar la expresión.

El mecanismo de acción de los potenciadores y los silenciadores tiene varias hipótesis. La más aceptada dice que los potenciadores actúan formando asas (loops). Al formar estas asas, las proteínas que reconocen a estas secuencias pueden interactuar físicamente con la maquinaria de transcripción. Otras hipótesis hablan de que las proteínas que se unen a los potenciadores o silenciadores se unen y se deslizan hasta llegar a los sitios de transcripción.

Para que se puede formar el asa existen proteínas que la estabilizan. Dicha configuración se obtiene en las fabricas de transcripción.





  • Aisladores:

También son elementos en cis las cuales como lo dice su nombre aíslan. Esto lo hacen por el siguiente mecanismo: supongamos que un mismo potenciador puede actuar sobre varias maquinarias de transcripción, por lo tanto sería un potenciador poco específico. El aislador se va a encargar de darle la especificidad para que no actúe sobre determinada maquinaria. Esto lo logran con cambios a nivel del plegamiento de la cromatina. Este efecto se puede dar sobre potenciadores o silenciadores.

  • Elementos trans:

Activador: proteína que reconoce al potenciador

Represor: son las proteínas que reconocen al silenciador

Promotores alternativos:


Un promotor es la secuencia reconocida por la maquinaria de transcripción. Es importante destacar que la cantidad de promotores por gen son variables, por lo que dependiendo de la ubicación de cada promotor se van a transcribir diferentes secuencias del mismo gen. Al no secuenciarse el gen completo se van producir fragmentos de ARNm que producen proteínas truncadas.

Las proteínas normalmente a la hora de ejercer su función forman complejos. Estos están formados por dímeros o heterómeros de la proteína. Las proteínas truncadas van a pasar a ser parte de dichos complejos por lo que van a ser funcionales. Estos promotores son regulados por sitios de unión a factores de transcripción distintos, esto permite que se regule la transcripción de secuencias del gen de manera diferencial, permitiendo la formación de proteínas truncadas distintas en una misma célula o entre células. El fin último de dicho proceso es producir proteínas truncadas distintas dependiendo de los factores de transcripción, lo cual genera que la función de los complejos proteicos sea distinta.



Se ha observado que los humanos y los ratones comparten gran parte del genoma. 95% de similitud. Muchas de las diferencias que se han visto corresponden a los sitios de unión para factores de transcripción. Se ha documentado que la mitad de los sitios de reconocimiento son distintos, y de la mitad que son iguales el acomodo es distinto. En la figura se observan tales diferencias.

Regulación postranscripcional:



Splicing alternativo:


Este proceso ocurre simultáneo al splicing. Por lo tanto luego de eliminar los intrones (splicing) se pueden eliminar ciertos exones (splicing alternativo). Esto permite producir proteínas distintas. A pesar de alterar el número de exones, el orden de los mismos no puede variar.

La regulación de este proceso es muy compleja. En ella el spliceosoma utiliza elementos U y más de 300 proteínas, las cuales reconocen los límites exón-intrón. Dependiendo de la fuerza de la secuencia de ARN de este límite determina cortar el exón. La fuerza de de la secuencia de ARN se determina por: la complementariedad de la secuencia con los elementos U, la arquitectura (tamaño) de los exones e intrones, la fosforilación de la cola de la ARN polimerasa y factores unidos a la ARN polimerasa, sitios de unión reguladores activadores o inactivadores, estructuras secundarias del ARN mensajero, estructura de la cromatina y los micro ARN. Como se puede ver es un proceso muy complejo en donde influyen gran cantidad de factores y como fin último permiten que el exón se elimine.

MicroARN:


Son parte del ARN no codificante, son pequeños de 24 nucleótidos, producidos por más de mil genes, regulan la expresión génica y el 60% de los genes en mamíferos son regulados por ellos.

Se producen de varias maneras:

  • A partir de genes individuales

  • Intrones no destruidos


Mecanismo de acción:

Cuando se produce por genes individuales se va a transcribir a partir de una secuencia de más de 1000pB. Al formarse el transcrito, éste presenta autocomplementariedad (se hibrida consigo misma) y forma una horquilla.

Esa horquilla es reconocida por gran cantidad de proteínas entre ellas la proteína Drosha. Estas proteínas cuentan ciertos nucléotidos y cortan produciendo un precursor de microARN que se va al citoplasma.

El precursor microARN es de doble hebra por estar en horquilla, esa doble hebra en el citoplasma es reconocida por un nuevo complejo que genera un corte al otro lado de la estructura hasta que queda 24 nucléotidos. Este nuevo ARN es reconocido por proteínas como al Argonauta (AGO), posterior a ello se elimina una de las hebras. Cuando solo queda una hebra, las proteínas usan la hebra que queda para escanear otros ARN, si esa hebra es complementaria absoluta a un ARN mensajero se marca para degradación. Mediante dicho mecanismo permite el silenciamiento de la expresión de genes.

Esa complementariedad absoluta se da en la región semilla la cual es del nucleótido 1 al 8 en el sentido 5-3 prima. La degradación se lleva a cabo mediante el reclutamiento de proteínas las cuales quitan la capucha o la cola poli A.

Si la complementariedad no es absoluta ocurre regulación a nivel de la traducción, se recluta un complejo que hace “algo” en la traducción, se cree que no permite el acoplamiento del ribosoma, o que cuando se inicia la traducción se suelte el ribosoma, o que se degrade la proteína mientras se forma.

Tradicionalmente los microARN son reguladores negativos. Sin embargo como se ve en la figura los microARN pueden ser potenciadores o silenciadores. Además el reconocimiento puede ser a nivel de ADN, actuando epigenéticamente. Además como se ve en la figura puede ser que active la traducción.
Todo esto depende de con que complejo se junte.




Regulación postraduccional:


Este es el último tipo de regulación, el cual ocurre en el momento en que la cadena de aminoácidos se ha formado. El ejemplo clásico es con el guardián del genoma. p53 es un factor de transcripción que se activa cuando hay daño en el ADN. Se produce constitutivamente pero inmediatamente es degradada a través de la MDM2 que le pega una ubiquitina. Con ello se regula que su expresión sea solo cuando se necesita salvar al genoma. Cuando hay daño se inhibe la MDM2 por lo que no hay ubiquitinación. Además de ello se activan quinasas que potencian más su función. Como fin último el p53 permite reparar el ADN, detener el ciclo celular y si el daño es irreparable, apoptosis.

Moraleja: “A fin de cuentas , cada proceso puee ser regulado a varios niveles” PhD. Sequiera.

Manipulación del ADN: algunas técnicas de análisis

PCR:


La reacción en cadena de la polimerasa permite replicar cierto segmento del ADN. Para este método ello se utilizan primers, nucléotidos, cofactores.

Pasos:

  1. Desnaturalización (95 C ): el ADN se separa

  2. Hibridación: a (60 C): se unen los primers para determinar la secuencia que se quiere replicar.

  3. Elongación (72 C) : durante este proceso la polimerasa reconoce el grupo OH y replica utilizando la hebra molde.

  4. Repetición del proceso (apox 30 ciclos)

Para su análisis se separan los fragmentos de ADN mediante una electroforesis en geles de agarosa. Muchas veces la PCR es el primer paso para el análisis genético, pero en algunos casos nos permite hacer un diagnóstico como en deleciones, en donde si existiera la deleción se observaría un fragmento de menor tamaño en la electroforesis.




Análisis de restricción:


En el análisis de restricción se utilizan las enzimas de restricción, las cuales son endonucleasas que reconocen secuencias específicas y generan un corte. Esto permite reconocer mutaciones en hotspots (sitios de alta tasa de mutación).

Al interpretar una prueba de estas, en el caso de que exista una mutación la enzima de restricción al estar diseñada para cortar la secuencia normal, no va a realizar el corte. Por lo tanto se va a conservar la secuencia del tamaño original la cual se puede observar mediante una electroforesis.

Secuenciación


Esta técnica implica equipos de alta tecnología. Permite establecer la secuencia exacta del ADN analizado. Para ello se amplifica una secuencia molde, agregando dinucleótidos con cloróforos. Estos dinucléotidos al ser didesoxinucleótidos no presentan grupo hidroxilo por lo que la ARN polimerasa no puede continuar la secuenciación y se produce un segmento específico. Esto ocurre miles de veces y por probabilidades se van a producir segmentos de todos los tamaños. Posteriormente dichos segmentos van a ser analizados e identificados por medios de los cloróforos.

Entonces por ejemplo si la máquina detecta un cloróforo azul en la posición 30, lo traduce como que existe una citosina en la posición 30, así sucesivamente. Al final se genera una gradiente de diferente tamaño que el aparato al a codificar a partir de una electroforesis. Esta técnica es el estándar de oro y sirve en muchísimos análisis.

PCR en Tiempo Real:


Esta técnica permite estudiar niveles de ARNm , con lo que mide expresión. Se utiliza en enfermedades donde no haya silenciamiento total, sino que existen alteraciones de la expresión. Para ello primero se usa una transcriptasa reversa que pasa el ARNm a ADNc.. Luego el ADNc se cuantifica en tiempo real.

Para cuantificarlo se utilizan dos técnicas:

  • Sybr Green: es una molécula que se une al ADNc cuando está en doble hebra y al unirse florece. Se mide la fluorescencia

  • Taqman: la sonda se pone en el centro de la secuencia de ADNc, esta sonda tiene una molécula que florece y un secuestrados (Quencher). Cuando las dos moléculas están juntas el secuestrador no deja que la otra molécula brille. al darse el PCR se degrada la sonda y se separan las molécula y la que es fluorescente, brilla.


Microarreglos


Son microchips con pozos que tiene ADN o ADNc conocido. Se depositan secuencias en los pozos. En el caso que ocurra la hibirdación, al conocer el ADN de los pozos se puede conocer la secuencia que se depositó en el mismo.

Knock out génico y condicional:


Permite silenciar genes y así estudiar su función

  • Génico: se genera una secuencia que posee a la vez secuencias marcadoras y silenciadoras, se introduce en el gen del ratón y con ello se apaga el gen. El problema con ello es que se inactiva el gen desde las células embrionarias, y esto puede silenciar o interferir con genes necesarios en el crecimiento.



  • Condicional: en la primera generación de ratones, el gen CRE /recombinasa, se introduce en un ratón, este gen se encuentra en forma silenciada. Tenemos otro ratón que se le inserta una secuencia LosP a los lados del gen que queremos silenciar. Se cruzan las cepas y el nuevo ratón expresa la recombinasa y el LosP, La recombinasa está silenciada en ese ratón. En determinado momento se activa dicha recombinasa. La recombinasa activada va a silenciar la expresión del gen delimitado por el LosP. Esta técnica permite controlar el momento y la célula específica que se va a silenciar..




Vectores virales:


Se utilizan virus para transportar el ADN que queremos integrar en el genoma del animal. Los virus por naturaleza inyectan los genes que se quieren sobreexpresar o silenciar.

ARN de interferencia:

Se inyecta un microARN el cual como se vio anteriormente silencia ARNm específico.

Ojalá se entienda, cualquier crítica me la dicen. Guiarse con las figuras.

Daniela Ruepert y Juan Diego Salazar

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