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Caracterización geno-fenotípica de aislados deEscherichia coli AEEC de pacientes pediátricos con procesos diarreicos infecciosos en la ciudad de La Paz: implicancias para el diagnóstico y epidemiología de las enfermedades diarreicas agudas

Geno-Phenotypic characterization of aeec Escherichia coli isolated from children with infectious diarrheal diseases in La Paz: relevancy for the diagnosis and epidemiology of acute diarrheal diseases

Dr: Samanta Sánchez*, Paola Ropmecin**, Luis Miguel Guachalla*** y Volga Iñiguez****

Instituto de Biología Molecular y Biotecnología, Unidad de Biología Molecular de Enteropatógenos, Carrera de Biología. Facultad de Ciencias Puras y Naturales. Universidad Mayor de San Andrés 
* Lic. Bioquímica 
** Lic. Biología 
*** Lic. Bioquímica 
**** Ph D. Biología 
* Autor correspondiente. Dirección: Instituto de Biología Molecular y Biotecnología, Campus Universitario de Cota-Cota. La Paz, Bolivia. E. mail:volgavir@hotmail.com 

Artículo recibido 1/10/2004 y fue aprobado para publicación 8/12/2004.
Resumen En el presente estudio se realizó la caracterización de Escherichia coli Enteropatogénica (EPEC) yEscherichia coli Enterohemorrágica (EHEC), dos categorías patogénicas de E. Coli, causantes de la lesión de adherencia y esfacelación (EAEE), en muestras de heces diarreicas de niños menores a 5 años. El perfil patogénico de EAEE se realizo mediante el análisis por PCR, de los genes intimina (eae), bundlina (bfpA) y toxinas siga (stx1 y stx2). Estas pruebas, se complementaron con ensayos fenotípicos de la resistencia a antibióticos, fermentación de sorbitol y producción de b-D-glucoronidasa. La prevalencia de EAEE fue del 7% con preponderancia de las cepas EPEC (95%) sobre EHEC. Se encontró una mayor proporción (83%) de cepas EPEC atípicas que típicas. Un alto porcentaje de los aislados de EPEC es resistente a más de 5 antibióticos analizados. La frecuencia de multiresistencia a bloques de 5 y 2 antibióticos sugiere que la resistencia es transmisible por vía horizontal. La correlación entre la pertenencia a un serogrupo particular de EPEC y las características genotípicas, mostró heterogeneidad en el perfil de patogenicidad tanto entre un mismo como entre diferentes serogrupos, demostrando que el diagnostico de DEC mediante serotipificación no es útil en nuestro medio. Los aislados de EHEC, se caracterizan por presentar una marcada susceptibilidad a los antibióticos. Se reporta la presencia de los serogrupos O157 y O6. Este estudio, constituye el primer reporte en nuestro medio sobre la determinación y caracterización geno-fenotípica de EPEC y EHEC por métodos moleculares. En conjunto, los datos obtenidos tienen relevancia para el diagnostico, tratamiento y estudio de la epidemiología de AEEC en las EDA en Bolivia.

Palabras Claves:

Rev Soc Bol Ped 2004; 43 (3): 132-43: Adherencia y Esfacelación (EA), Bundlina (BFP), Intimina (EAE), Toxina Shiga (STX).
Abstract

In this study, enteropathogenic (EPEC) and enterohemorrhagic (EHEC) E. Coli, two E. Coli categories causing attaching and effacing lesions, were isolated and characterized from children with diarrhea less than 5 years of age. The AEEC pathogenic profile was analyzed by PCR for the presence of the intimin (eae), bundle-forming pilus (bfpA) and Shiga toxin (stxstx2) genes. Phenotypic analysis for the presence of antibiotic multi-resistance, sorbitol fermentation and B-D glucoronidase were also performed. AEEC prevalence was 7%. EPEC accounted for 95% of the isolates of which 83% were atypical. A high percentage of EPEC isolates is resistant to more than 5 antibiotics. The multi-resistance frequency to 5 and 2 antibiotics suggest antibiotic resistance transmission by lateral transfer. The lack of correlations between EPEC serogroups and genotypic strain profile demonstrates that serological DEC diagnosis is not useful for local isolates. EHEC isolates were remarkably susceptible to most of the antibiotics tested. The isolation of 0157 and 06 serogroups is reported. This is the first report of EPEC and EHEC molecular strain characterization. The results described are relevant for EAEE diagnosis, treatment and epidemiology of diarrheal diseases in Bolivia.

Key words:

Rev Soc Bol Ped 2004; 43 (3): 132-43: Attaching and Effacing (EA), Bundlina (BFP), Intimin (EAE), Shiga toxin (STX).

Introducción


A nivel mundial, las Enfermedades Diarreicas Agudas (EDAs), son un problema importante de salud de la población infantil, principalmente en los países en desarrollo donde se producen anualmente entre 4,6 a 6 millones de muertes constituyendo la segunda causa global de mortalidad infantil. Estas estadísticas se reflejan en que se produce un promedio de 3 episodios de diarrea por año en niños menores a 5 años y una tasa global de mortalidad promedio de más de 10.000 niños por día1-3.

En Bolivia, las EDA constituyen una de las principales causas de mortalidad entre niños menores de 5 años de edad, produciéndose aproximadamente quince mil muertes por año4.

La diversidad de enteropatógenos asociada a las EDA y la falta de acceso a tecnologías sensibles de diagnostico, determinan que, similar a otros países en desarrollo, se desconozca la etiología de una gran parte de los episodios diarreicos infecciosos, los cuales se tratan, por lo general sin conocimiento de la patología subyacente.

Es así que la epidemiología de los principales patógenos asociados a la gastroenteritis infantil y los mecanismos de virulencia, son poco conocidos en nuestro medio.

En los últimos años, un número creciente de patógenos bacterianos y virales han sido asociados a las EDA gracias a la progresiva incorporación de nuevas tecnologías de detección, que han permitido establecer la relación causal entre los microorganismos y las EDA, mediante la identificación y caracterización de genes de patogenicidad y virulencia.

Entre las bacterias asociadas a las EDA, Escherichia coli Diarreogénica (DEC) esta comúnmente asociada a formas endémicas e incluye al menos 6 categorías patogénicas bien definidas, las cuales comprenden a E. Colienteropatogénica (EPEC), E. Coli enterohemorrágica (EHEC), E. Coli enterotoxigénica (ETEC), E. Colienteroagregativa (EAEC), E. Coli enteroinvasiva (EIEC) y E. Coli adherente difusa (DAEC). Estos "patotipos" se distinguen de los simbiontes de la flora normal, por la presencia de factores de virulencia adquiridos principalmente por transferencia horizontal a partir de plásmidos, fagos y genomas de otras bacterias"5.

EPEC y EHEC son dos categorías patogénicas de E. Coli que causan la lesión del tipo de "adherencia y esfacelación" (A/E) en las células intestinales. Esta lesión se caracteriza por la destrucción de las microvellosidades de la membrana, la adherencia intima de la bacteria al epitelio intestinal, el reordenamiento del citoesqueleto de la célula huésped, la formación de un pedestal y la iniciación de varías señales de transducción generadoras de la secreción intestinal.

EPEC es uno de los patógenos bacterianos más importantes asociado a la gastroenteritis infecciosa y diarrea esporádica en niños menores a dos años6-12. Además de producir la lesión A/E, EPEC presenta generalmente un plásmido denominado EAF (factor de adherencia de EPEC) relacionado tanto a la adherencia entre bacterias, así como a las células epiteliales del intestino13.

EHEC, por su parte es un patógeno emergente de las últimas décadas, que se caracteriza por producir las citotoxinas Shiga causando diarrea no sanguinolenta, colitis hemorrágica y síndrome hemolítico urémico (SHU)14-15.

Con el propósito de contribuir al conocimiento de la etiología bacteriana de las EDA, en el presente trabajo, se utilizo un conjunto de ensayos genotípicos y fenotípicos para identificar, caracterizar y comparar a EPEC y EHEC, en muestras de heces fecales de pacientes pediátricos con Procesos Diarreicos Infecciosos (PDI). Entre las características analizadas se incluyen a genes de patogenicidad, patrones de resistencia a antibióticos y marcadores bioquímicos. Asimismo, se analizo la validez de la asignación de EPEC en base a la pertenencia a sus serogrupos característicos.

Estos datos, constituyen el primer reporte en Bolivia sobre el aislamiento y análisis de las categorías de DEC causantes de la lesión A/E (AEEC) a partir de heces diarreicas de niños menores a 5 años. Los resultados obtenidos remarcan una mayor prevalencía de EPEC atípica sobre EHEC, heterogeneidad geno-fenotípica de cepas EPEC y EHEC, alta proporción de cepas multiresistentes a 7 antibióticos entre aislados de EPEC, en fuerte contraste a EHEC y la discordancia en la clasificación de EPEC mediante serogrupos con relación al perfil patogénico.

La diversidad genotípica encontrada entre las cepas AEEC, circulantes en los PDI tiene relevancia clínica y epidemiológica para el estudio del rol de EPEC y EHEC en las EDA en nuestro medio.


Material y métodos


Cepas control y cepas clínicas. Se utilizaron cepas de referencia de E. Coli Diarreogénicas (DEC) provenientes del Instituto de Genética Evolutiva y Molecular, de la Universidad Estatal de Pennsylvania, Estados Unidos de Norte América.

Asimismo, se analizaron 31 cepas clínicas de E. Coli, que presentan serogrupo definido, las cuales fueron aisladas en La Paz, Bolivia en 1993 a partir de muestras fecales de niños con PDI.

Población de estudio. En el periodo de Febrero del 2001 a Junio del 2002, se recolectaron 882 muestras de heces fecales provenientes de niños menores a 5 años de edad, con PDI en tres centros de salud de la ciudad de La Paz (Hospital Materno Infantil, Hospital Militar y Hospital del Niño Ovidio Aliaga).

Aislamiento y caracterización fenotípica de E. Coli. Las muestras fecales fueron sembradas e incubadas en Agar MacConkey, durante 18 horas a 37° C. Las colonias fermentadoras de lactosa y con morfología característica de E. Coli, fueron luego analizadas por su capacidad de fermentación de sorbitol (FS) y producción de b-D-glucoronidasa (MUG).

Resistencia a antibióticos. Se consideraron para el análisis a los siguientes antibióticos: ampicilina, eritromicina, estrepto-micina, sulfatrimetoprim, ácido nalidixico, cloranfenicol, tetra-ciclina y gentamicina. La sensibilidad a los ocho antibióticos se evaluó mediante el método de difusión de disco acorde a los lineamientos del Comité de Control de Laboratorios Clínicos16.


Caracterización genotípica


Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La presencia de los genes eae (región variable y constante),bfpstx1stx2 y mdh correspondientes a las proteínas Intimina, Bundlina, Shiga toxina 1, Shiga toxina 2 y Malato-deshidrogenasa respectivamente, se realizo en los aislados de E. Coli, mediante el uso de cebadores específicos (Cuadro # 1).

http://www.scielo.org.bo/img/revistas/rbp/v43n3/cuadro_a02_1.gif

Los productos de PCR se visualizaron por electroforesis en geles de agarosa al 1% con bromuro de etidio, en un transiluminador de luz UV.

Análisis por PCR-RFLP. Los fragmentos amplificados del gen eae y bfp se incubaron con las enzimas de restricción Dra I y Msp I respectivamente, por dos horas a 37°C. Posteriormente, los productos de digestión fueron separados por electroforesis en geles de agarosa (NuSieve) al 4% con bromuro de etidio y visualizados con un transiluminador de luz UV.

Procesamiento de datos. Los datos fueron analizados por el test exacto de Fisher. La asociación se considero estadísticamente significativa, con un valor de p< 0.05.


Resultados


Diferenciación molecular de EPEC y EHEC mediante PCR. En la Figura # 1, se observan los productos amplificados mediante PCR, de regiones de los genes eaeAstx1, mdh, bfpA y stx2, presentes en cepas de referencia. Los ensayos fueron específicos detectando todos los genes de interés en el 100% de las cepas control de genotipo y fenotipo múltiple (datos no mostrados). El análisis de estos genes en las muestras clínicas permitió la identificación de cepas EPEC y EHEC.

http://www.scielo.org.bo/img/revistas/rbp/v43n3/figura_a02_1.jpg

La presencia del gen mdh permitió confirmar que las cepas eran de la especie E. Coli. 

EPEC: Identificación y caracterización en muestras clínicas.
 Del total de 882 muestras clínicas, 58 aislados de E. Coli presentaron genotipo eaestx- siendo clasificados como EPEC. Esto represento una prevalencía de infección por EPEC de 6% en el periodo de estudio (Cuadro # 2).

http://www.scielo.org.bo/img/revistas/rbp/v43n3/cuadro_a02_2.gif

El producto de amplificación del gen eaeA (863pb), fue verificado en el total de cepas eaeA + mediante PCR-RFLP. En el 96% de las mismas, se obtuvo el fragmento esperado de 750pb, correspondiente al extremo 3' de la región amplificada (datos no mostrados).

El gen bfpA, codificante de la bundlina o subunidad estructural del pilus BFP fue detectado en el 17% de las cepas eae+ aisladas en el periodo 2001-2002 representando consiguientemente un total de 10 cepas EPEC típicas y 48 atípicas (Cuadro # 2).

El análisis de las cepas clínicas de E. Coli aisladas en el periodo 1993, mostró que 15 de 31 cepas presentaron el gen eaeA (Cuadro # 3). En este grupo de muestras, se observó un 47% de cepas EPEC típicas.

http://www.scielo.org.bo/img/revistas/rbp/v43n3/cuadro_a02_3.gif

EPEC: Caracterización genética de las intiminas a, b y g. La identificación genética de tres tipos de intimina (a, b y g), se realizó mediante PCR de la región variable del gen eaeA en 72 cepas eae+ que incluyeron a: 15 aislados de 1993 y 57 del período 2001-2002 (Figura # 2).

http://www.scielo.org.bo/img/revistas/rbp/v43n3/figura_a02_2.jpg

De las cepas analizadas entre el 2001-2002, 3% corresponden al gen de la intimina a, 9% al de la intimina b y 16% al de la intimina g. En el 72% restante, no se observaron productos de amplificación; por lo cual, estas cepas fueron clasificadas como no tipeables (Cuadro # 2).

Se observa que la proporción de cepas no tipeables fue menor entre los aislados de 1993 (20%) con respecto al periodo 2001-2002. El porcentaje de cepas de intimina tipo g fue mayor que el de las otras variantes de intimina identificadas. No se observaron cepas con intimina a en 1993 (Cuadro # 3 y figura #3).

http://www.scielo.org.bo/img/revistas/rbp/v43n3/figura_a02_3.jpg

La distribución del tipo de intimina entre las cepas típicas y atípicas aisladas en el 2001-2002, reveló que las intiminas b y g están presentes en cepas de genotipo bfpA+ y bfpA- aunque con mayor predominio en estas ultimas. Las dos cepas de tipo a encontradas, son atípicas.
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