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Segunda Parte:


Diluciones, cálculos de concentración y soluciones buffer
1) La disolución "A" es 2 mM. La disolución "B" es 2 µM. ¿Cuántas veces más concentrada es A que B? ¿Cuál es el factor de dilución para preparar B a partir de A?

2) Un procedimiento requiere la preparación de diluciones 1/10 sucesivas de la muestra (también llamadas diluciones seriadas). Si quieres muestras de 1 ml, ¿cómo procederás para preparar la serie de diluciones? ¿Cuál será la concentración relativa tras cuatro de tales diluciones?

3) Tienes una solución de proteínas y, tras realizar un ensayo de medida de concentración, te das cuenta de que la tendrás que diluir para obtener una lectura de absorbancia fiable. Diluyes la muestra 1:1 tres veces sucesivas y cada una de ellas sigue estando demasiado concentrada. Por último, desesperado, diluyes 1/10 la última muestra que has preparado y por fin la puedes medir. El resultado es 100 µg/ml. ¿Cuál es la concentración de la muestra original?

AYUDA. Una "dilución 1:1" indica que se mezcla una cantidad de solución inicial con una cantidad igual (en volumen) de agua. Es, por tanto, lo mismo que decir una dilución 1/2, o un factor de dilución 2.

Otros ejemplos:

 1:2 = 1/3
  1:5 = 1/6
  3:7 = 3/10

4) A partir de una solución stock de Cefalotina (1mg/ml) se desean preparar 10 ml de las siguientes concentraciones: 100 g/ml; 20 g/ml y 5 g/ml. Calcular los volúmenes de solución stock para cada caso.

5) A partir de una solución stock de Nistatina (1% p/v) se desean preparar 5 ml de una concentración de Nistatina de 0,2 g/ml. Explique cómo procedería para realizar esta preparación? Considerar que cuenta con micropipetas que pueden medir volúmenes entre 10-100 l y 50-200 l.

6) El ácido acético es empleado habitualmente en el laboratorio, en pequeñas cantidades, para detener algunas reacciones enzimáticas. Dispone de un frasco con 1 L del reactivo puro y desea preparar 15 ml de concentración 0,5 M. Explique cómo procedería para realizar esta preparación y si necesitaría algún otro dato complementario.

7) Se necesitan preparar 50 ml de una solución para lisar bacterias conteniendo NaOH 0,2 N y SDS 1 % p/v. Se dispone de:

NaOH 10 N

SDS 10 % p/v

NaOH (sólido) PM= 40

8) Se tiene una proteína cuya concentración se desea obtener. Para ello se elige un método espectrofotométrico usando la siguiente dilución:

10 μl de solucion proteica + 990 μl de buffer

Se mezclan y se determina una concentración de 20 μg/ml (método de Lowry). ¿Cuál es la concentración de la solución proteica original?
Cuestionario Nº 2

Compartimentos intracelulares y tráfico de proteínas.


  1. Completa las siguientes oraciones.




  1. El destino de las proteínas sintetizadas en el citosol depende de su secuencia de aminoácidos, la cual puede contener ___________________________ que dirigen su distribución al exterior del citosol.

  2. La selectividad del transporte nuclear reside en señales de ____________________ las cuales se encuentran sólo en las proteínas nucleares.

  3. Desde el interior hacia el exterior los cuatro componentes de la mitocondria son la _____________, la ____________________, el ________________________ y la __________________________.

  4. Los cloroplastos poseen un compartimento extra limitado por membranas conocido como _________________________________.

  5. Los ___________________________al igual que el RE son organelas limitadas por membranas, autoreplicantes, que existen sin un genoma propio.

  6. Las plantas, pero no los animales, pueden convertir ácidos grasos en azúcares por una serie de reacciones conocidas como el __________________________, por lo cual los peroxisomas son llamados también____________________________.

  7. La membrana del________________________ constituye típicamente más de la mitad de la membrana de una célula, y el espacio interno llamado _______________________________, frecuentemente ocupa más del 10% del volumen celular total.

  8. El péptido señal es guiado a la membrana del RE por al menos dos componentes: una_____________________________________________________, la que se une al péptido señal en el citosol, y el________________________________ que se ubica en la membrana del RE.

  9. La mayoría de las proteínas solubles y unidas a membrana secuestradas en el lumen del RE son________________________________, que poseen azúcares unidos covalentemente.


2) ¿Qué son los hoyos revestidos (coated pits) y las vesículas revestidas (coated vesicles)? ¿De qué están revestidos?

3) ¿Qué función cumplen el REL y el RER?

4) ¿Qué estructuras conforman el aparato de Golgi? ¿Qué funciones tiene el mismo? ¿Y específicamente en células vegetales?

5) ¿En qué compartimento celular se glicosilan las proteínas? ¿Qué ocurre con las cadenas de oligosacáridos unidas a proteínas en el aparato de Golgi?

6) ¿Qué destino celular tienen las proteínas cuyo ARNm codifica para una secuencia hidrofóbica (péptido señal) en el extremo N-terminal?

7) ¿Cuál es el efecto del antibiótico tunicamicina?

8) La mayoría de las proteínas que se sintetizan en el RER presentan una o más cadenas de carbohidratos. Algunas de las etapas de glicosilación de estas proteínas ocurren en el RER y otras en el complejo de Golgi. Para identificar el organelo en el cual un monoscárido en particular se adiciona a las proteínas, se diseñó el siguiente experimento:

Grupo de ratones se inyectaron por separado con 3H-manosa y con 3H-galactosa y se sacrificaron 10 min después de la inyección. Se extrajeron trozos de intestino grueso y se procesaron, según el método radiautográfico, obteniéndose los resultados que se muestran en la tabla:

Distribución de marca radiautográfica en células caliciformes incubadas con azúcares radiactivos


Azúcar

Compartimentos subcelulares con marcas radiautográficas

RER

Complejo de Golgi

Gránulos de secreción

3H-manosa

+++

-

-

3H-galactosa

-

+++

-




  1. ¿Cómo interpreta que después de la inyección con 3H-manosa, toda la marca radiautográfica se observe en el RER, mientras que para la 3H-galactosa se encuentre en el complejo de Golgi?

  2. Confeccione una tabla en la que exprese los resultados de una distribución hipotética de la marca radiautográfica después de 10, 20 y 40 min de la inyección de ambos azúcares radiactivos.

  3. Si en lugar de inyectar 3H-galactosa, se inyectan 3H-N-acetilglucosamina, ¿qué organelo(s) esperaría encontrar con marca radiactiva después de 10 min de la inyección?


9) En el complejo de Golgi existe una variedad de enzimas que participan en la glicosilación de proteínas y lípidos que son procesados en este organelo. Dos de ellas, la galactosil y sialil-transferasa (GT y ST) están presentes en las membranas de las cisternas del complejo de Golgi. Considerando que la principal función biológica de estas enzimas es la modificación de las proteínas de secreción, se suponía que su sitio activo debería estar orientado hacia el lumen de las cisternas. Para demostrar esta hipótesis se utilizaron complejos de Golgi aislados por gradiente de sacarosa. En ellos se estudió la actividad de las enzimas GT y ST. Básicamente se aplicaron tres criterios operacionales: a) el efecto de detergente (Tritón X-100) sobre la actividad de GT y ST de las vesículas; b) el efecto de tripsina sobre la actividad de GT y ST de las vesículas; y c) el efecto del antibiótico filipina sobre la susceptibilidad a tripsina de las transferasas.

Los resultados se expresan en la Tabla y figura


Tratamiento de las

vesículas

Actividad Específica

GT (nmoles/mg proteína/h)

ST (nmoles/mg de proteína/h)

Sin tratamiento

320

56

Tritón X-100

531

107

Tripsina

320

56

Tritón X-100/Tripsina

0

0


a) ¿Para qué se utilizó el tritón X-100, la tripsina y filipina?

  1. ¿Cómo interpreta Ud. los resultados de este experimento?

  2. ¿Cuál sería la orientación del sitio activo de las enzimas GT y ST si éstas estuvieran presentes en la membrana plasmática del hepatocito?


10) El complejo de Golgi se considera como un organelo formado por una serie de compartimientos estructural y funcionalmente distintos, que poseen enzimas y moléculas propias. Por estudios bioquímicos e inmunocitoquímicos se han identificado la localización de diferentes enzimas que participan en la glicosilación de proteínas en el complejo de Golgi (ver gráfico).


Enz.1: N-acetilglucosamina fosfotransferasa

Enz. 2: Manosidasa I

Enz. 3: Manosidasa I/N-acetilglucosamina transferasa

Enz. 4: Galactosil transferasa

Enz. 5: Sialiltransferasa


En un estudio para investigar el procesamiento de los oligosacáridos de glicoproteínas en el complejo de Golgi se utilizaron células ováricas de hamster normales y mutantes para alguna de las enzimas que participan en la glicosilación en el complejo de Golgi. Tanto las células normales como las mutantes fueron infectadas con el virus de la estomatitis vesicular (VEV), el que contiene una única glicoproteína, la proteína G, que es una glicoproteína de membrana que tiene dos sitios de glicosilación para N-oligosacáridos complejos iguales. El VEV al infectar las células utiliza la maquinaria de síntesis proteica de la célula huésped para sintetizar sus propias proteínas. Así, en el complejo de Golgi de una célula infectada hay gran cantidad de proteína G. Se aislaron las membranas del complejo de Golgi de las células infectadas utilizando centrifugación en gradiente de sacarosa. Previo tratamiento de estas membranas con detergente, se aisló la proteína G y se analizaron los azúcares que formaban los oligosacáridos de las glicoproteínas presentes en las distintas células infectadas. A continuación se presenta la tabla:


Línea celular

Manosa

N-acetilglucosamina

Galactosa

NANA*

Glucosa

Normales

3

5

3

3

0

Mutante A

5

2

0

0

0

Mutante B

5

3

1

1

0

Mutante C

3

5

0

0

0

Mutante D

3

5

3

0

0

Mutante E

8

2

0

0

0

*NANA: ácido N-acetilneuramínico

Responder:

a) ¿Cuál es la enzima que está ausente en cada una de las células infectadas?
11) La siguiente es una clave dicotómica que permite identificar proteínas de acuerdo a su localización precisa en los distintos compartimentos de una célula eucariota. Los caracteres (o “etiquetas”) mencionados corresponden a los de los precursores de las proteínas maduras.

a) Asigne correctamente el número de una o más proteínas de las listadas más abajo, a cada casillero de la clave. Ayuda para el uso de la clave: Para cada proteína compare los dilemas de igual jerarquía (A y AA, por ejemplo). Si la proteína pertenece a A, entonces continúe comparando los dilemas B y BB. Si la proteína pertenece a AA, entonces continúe comparando los dilemas G y GG.

Clave:

A. Con péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce al srp (“signal recognition particle”) y secuencia de reconocimiento para la peptidasa de la señal.

B. Con péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje).

C. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal.............______

CC. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal.............______

BB. Sin péptido hidrofóbico interno “stop transfer” (de anclaje).

D. Con secuencia de retención KDEL...................................______

DD. Sin secuencia de retención KDEL.

E. Con secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal.

F. Con señal conformacional para adición de Man-6P______

FF. Sin señal conformacional para adición de Man-6P______

EE. Sin secuencia Asn-X-Ser/Thr en porción N-terminal.....______

AA. Sin péptido señal hidrofóbico N-terminal que reconoce srp.

G Con péptido “señal” para translocación a mitocondria.

H. Con péptido de anclaje a membrana mitocondrial...................______

HH. Sin péptido de anclaje a membrana mitocondrial...................______

GG. Sin péptido “señal” para translocación a mitocondria.

I. Con secuencia SKL de entrada a peroxisoma........................______

II. Sin secuencia SKL de entrada a peroxisoma.

J. Con secuencia básica de transporte a núcleo................______

JJ. Sin secuencia básica de transporte a núcleo................______

Lista de proteínas a asignar:

1. Bip, proteína soluble que pliega proteínas en el lumen del retículo endoplasmático.

2. Insulina, hormona proteica no glicosilada.

3. Tubulina, proteína del citoesqueleto

4. Catalasa, enzima del peroxisoma

5. Factor de transcripción

6. Receptor de LDL (lipoproteína de baja densidad), proteína glicosilada de membrana.

7. Enzima del ciclo de Krebs

8. Subunidad del receptor de acetilcolina, proteína no glicosilada de membrana.

9. Hidrolasa ácida

10. Fosfofructoquinasa, enzima glucolítica.

11. Subunidad de membrana de la ATPasa mitocondrial

b) Hay un casillero que queda vacío, ¿a qué tipo de proteínas corresponde?
12) Los pacientes que sufren de una enfermedad genética severa conocida como la enfermedad de las células-I tienen los lisosomas de sus macrófagos y fibroblastos repletos de glicolípidos y componentes celulares. En estas personas, se observa una incapacidad de retener las enzimas lisosomales responsables de la digestión de glicolípidos y debris celular.

Investigaciones sobre este tema han demostrado que estos individuos son capaces de producir enzimas lisosomales funcionales. Sin embargo, en vez de dirigirlas hacia los lisosomas, las enzimas son secretadas.

  1. Utilizando tus conocimientos, sugiere posibles defectos y mecanismo(s) para explicar el fenotipo de pacientes con la enfermedad de las células-I.

  2. Se ha observado que fibroblastos cultivados de pacientes con la enfermedad de las células-I son capaces de incorporar enzimas lisosomales de individuos normales cuando estas se agregan al medio de cultivo. Estos cultivos de células también fueron capaces de tomar las enzimas lisosomales del propio paciente cuando estas eran modificadas in vitro por una enzima fosforilativa. A partir de estos datos, ¿qué modificaciones realizarías a las hipótesis formuladas en el punto anterior?

  3. La enfermedad de Gaucher (ver cuadro anexo: Medicina molecular) es otra enfermedad relacionada con el almacenamiento de enzimas en los lisosomas, en este caso una enzima lisosomal específica es no funcional. Los fibroblastos de estos pacientes son capaces de tomar la enzima cuando esta se adiciona al medio de cultivo. ¿Qué receptor debe estar presente en la superficie celular para que esto ocurra? Describe una estrategia para tratar a los pacientes con la enfermedad de Gaucher usando las observaciones realizadas sobre los cultivos celulares.





Extraído de Cooper, La Célula.

Cuestionario Nº 3

La membrana plasmática
1) ¿Qué es una molécula anfipática?

2) ¿Qué tipo de lípidos forman la membrana plasmática?

3) ¿Qué proteínas se extraen de la membrana por tratamiento con:

a) soluciones salinas?

b) detergentes?

c) tripsina sobre la célula intacta?

d) tripsina sobre preparaciones de membrana?

4) ¿Qué significa que la membrana es: a) asimétrica, b) semipermeable?

5) a-¿Cuál de las siguientes funciones no corresponde a los triacilgliceroles?

1. almacenamiento de energía

2. aislamiento

3. estructura de la membrana

b- ¿Cuál de las siguientes propiedades de las membranas biológicas no son directamente responsables los lípidos?

1. permeabilidad selectiva

2. capacidad de repararse

3. fluidez

4. transporte activo de iones

5. asimetría

c- De los siguientes lípidos de membrana indicar los componentes que constituyen las regiones hidrofóbicas e hidrofílicas:

1. fosfatidiletanolamina

2. esfingomielina

3. galactosilcerebrósido

4. gangliosido

5. colesterol

  1. Explique por qué el O2 atraviesa fácilmente una membrana biológica, y en cambio los H+ no, pese a que los protones son más pequeños que el O2.

7) ¿ De dónde proviene la energía para transportar glucosa al interior de la célula en contra de su gradiente de concentración, en el caso del cotransporte con el Na+ ?

8) ¿En cuál de los siguientes casos la superficie interna de una membrana sellada o vesícula se convierte en la superficie exterior de la misma?

  1. Fusión de dos vesículas intracelulares

  2. Exocitosis de una vesícula secretoria

  3. Transferencia de membrana del RE hacia la membrana del Golgi, vía formación y fusión de vesículas, como en el caso del transporte de enzimas digestivas pancreáticas.

  4. Endocitosis de una bacteria por un leucocito.

  5. División de una célula bacteriana.

9) Determine cuantas membranas de distintos compartimentos topológicos deben ser atravesadas para ir desde:

  • El espacio periplasmático de una célula procariota hacia su ADN.

  • La matriz interna de una mitocondria vegetal hacia la matriz interna de un cloroplasto en una célula vecina.

  • El interior del núcleo hacia el exterior de la misma célula.

  • El interior del RE a través del Golgi hacia el exterior celular.


10) Un amigo suyo regresó de un safari calamitoso. Mientras cruzaba el Río Limpopo, fue mordido por una serpiente de agua venenosa que le provocó una hemólisis por la que casi muere. Biólogo de alma, su amigo capturó la víbora y antes de morir le pide a ud. que analice el veneno para descubrir las bases de su actividad hemolítica.

Ud. encuentra que el veneno contiene proteasa (la cual rompe uniones peptídicas entre proteínas), una neuroaminidasa (remueve residuos de ácido siálico gangliósidos) y una fosfolipasa (cliva enlaces de fosfolípidos).

Tratamientos de hematíes con esta actividad purificados dieron los siguientes resultados:


Enzima purificada

Hemólisis

Proteína

Negativo

Neuroaminidasa

Negativo

Fosfolipasa

Positivo


El análisis de los productos de la hemólisis por tratamiento con fosfolipasa mostraron un gran aumento de fosforilcolina (colina con un grupo fosfato unido) y diacilglicerol (glicerol más dos cadenas de ácidos grasos unidos).

  1. ¿Cuál es el sustrato de la fosfolipasa y dónde cliva?

  2. Explique por qué la fosfolipasa produce lisis de los glóbulos rojos de la sangre, pero la proteasa y la neuroaminidasa no.


11) La enzima X es una proteína de membrana mitocondrial interna y está formada por dos polipéptidos (a de 40000 Da y b de 22000 Da) unidos por fuerzas no covalentes. Se dispone de preparaciones de membranas mitocondriales abiertas y de mitocondrias sometidas a diversos tratamientos, obteniéndose las siguientes fracciones:

TRATAMIENTOS


En las distintas fracciones se ensayó la actividad enzimática y la composición polipeptídica de la proteína X.



Puede concluirse que:

a- El polipéptido ______ es una proteína integral de membrana.

b- El polipéptido ______ es una proteína periférica.

c- El polipeptido que es integral tiene su extremo N-terminal orientado hacia el espacio intermembrana / citoplasma y su extremo C-terminal orientado hacia el espacio intermembrana / citoplasma.

d- La actividad enzimática de la proteína X depende de la presencia de: a / b / a+b.

e- El polipeptido que es periférico está ubicado en la cara citoplasmá­tica / del espacio intermembrana de la membrana externa mitocondrial. Justifique.

f- La actividad de x depende/ no depende de los péptidos unidos a a. .

g- ¿En qué compartimentos celulares se sintetizan los polipéptidos a y b? Justifique.
12) Ud. quiere determinar la distribución de los fosfolípidos en la membrana plasmática de las células de los glóbulos rojos de la sangre. Los fosfolípidos constituyen el 60% de los lípidos en la bicapa celular, con el 23% de colesterol y 3% de glicolípidos.

Entre los fosfolípidos encontramos fosfatidilcolina (17%), fosfatidiletanolamina (18%), esfingomielina (18%), fosfatidilserina(7%) y el resto distribuído entre una variedad de fosfolípidos.

Para medir la distribución de los fosfolípidos individuales, hace reaccionar glóbulos rojos intactos y fantasmas de eritrocitos con:

1) 2 fosfolipasas diferentes y

2) con un agente fluorescente impermeable a la membrana (SITS) el cual marca específicamente grupos amino primarios.

El tratamiento con esfingomielinasa degrada más del 85% de esfingomielina en eritrocitos intactos (sin causar lisis) y un poco más en fantasmas de eritrocitos.

Las fosfolipasas del veneno de las serpientes de mar liberan únicamente productos de la degradación de la fosfatidilcolina en células intactas (sin lisis), pero en fantasmas de eritrocitos degradan fosfatidilcolina y fosfatidilserina. SITS marca casi totalmente fosfatilserina y etanolamina en fantasmas de eritrocitos pero reacciona menos del 1% en células rojas intactas.

a- De acuerdo a estos resultados deduzca la distribución de los cuatro fosfolípidos principales en las membranas de eritrocitos.

b- ¿Cuál de los fosfolípidos (si hay alguno) está localizado en ambas monocapas de la membrana?
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