Composición Química del Glifosato




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Análisis estadístico

La evaluación de la biodegradación de glifosato por las bacterias escogidas y sus mezclas se llevó a cabo mediante un diseño completamente al azar con seis tratamientos, tres repeticiones y tres unidades experimentales por repetición para un total de 42 unidades experimentales. Esto quiere decir que por cada bacteria y sus mezclas (Tratamientos) se realizaron nueve cromatografías.

Los promedios de los datos obtenidos se trataron estadísticamente mediante un análisis de varianza

(ANOVA) de una sola vía (P= 0,05) y con la prueba de Rango Múltiple de Duncan, para determinar las diferencias significativas encontradas entre tratamientos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Cultivo, aislamiento e identificación
Se aislaron cinco géneros bacterianos que utilizaron el glifosato como única fuente de carbono, predominando Pseudomonas spp. Con un 42, 9 %. Las especies aisladas de este género fueron cercanas a P. cichorii, P. aeruginosa, P. fluorescens, P. stutzeri y P. vesicularis. También se aislaron cepas cercanas a Burkholderia cepacia, B. gladioli, Alcaligenes sp., Flavimonas

oryzihabitans y Pantoea aglomerans.

Estos resultados concuerdan con varios estudios reportados a nivel mundial, los cuales han encontrado degradación del glifosato y de otros compuestos organofosfonatos por diferentes microorganismos del suelo, principalmente por varias especies del género Pseudomonas spp.

Es importante resaltar que los anteriores estudios aislaron estas bacterias edáficas en medios de cultivo donde el glifosato se usó como única fuente de fosforo y es así que para Shushkova et al. (2009) y Moneke et al. (2010), la regla general es que los microorganismos del suelo lo utilicen como fuente de fosforo, debido a que estos investigadores comprobaron que el glifosato es mejor fuente de fosforo que de carbono. Sin embargo, al igual que este estudio, en plantaciones de soya (Glycine max L.) sobre suelos brasileños con historial de uso de herbicidas a base de glifosato, se aislaron B. gladioli y Flavimonas (Antes Pseudomonas) oryzihabitans en medios que contenían glifosato como única fuente de carbono (Kuklinsky-Sobral et al., 2005). En Colombia, en suelos arroceros del departamento de Tolima, se identificaron como degradadores de glifosato al actinomiceto Streptomyces sp, la bacteria Microccocus luteus y el hongo Memnoniella sp (Rodríguez, 2005)
Métodos analíticos

Prueba turbidimétrica y curva de crecimiento bacteriano.

Por medio espectrofotométrico, se escogieron las bacterias P. aeruginosa, B. gladioli, P. fluorescens y F. oryzihabitans que presentaron una mayor absorbancia con respecto al resto de bacterias analizadas en los medios de cultivo que contenían glifosato como única fuente de carbono, indicando una mejor utilización del herbicida por estas especies bacterianas (Moneke et al.,2010)

Todas las bacterias escogidas crecieron bien con glifosato como única fuente de carbono. La fase de adaptación al herbicida fue más larga en F. oryzihabitans y B. gladioli con un promedio de 72 horas; mientras que en P. aeruginosa y P fluorescens, la duración fue de 48 y 12 h respectivamente (Figura 2) Estos resultados sugieren que estas bacterias posiblemente se adaptaron y utilizaron más fácilmente al glifosato como única fuente de carbono y concuerda con los crecimientos celulares presentados por P. putida en un medio de cultivo similar con una fase de adaptación (lag) de aproximadamente 8 horas y P. fluorescens con una fase lag de aproximadamente 12 horas con 2,5% de glifosato (Sun et al., 2005; Moneke et al., 2010) En la naturaleza la eficiencia en la degradación de glifosato está dada por la relación planta microorganismo,las especies vegetales y microbianas, el tipo de suelo, dosis aplicada y condiciones experimentales (Dos Santos et al., 2006; Krzysko-Lupicka y Sudol, 2008; Santos et al., 2009)

Figura 2. Curvas de crecimiento de las bacterias escogidas en medio liquido con glifosato al 1% y extracto de levadura como fuentes de carbono y nitrógeno (medio G3)

Estudios realizados con diferentes bacterias como Acetobacter sp., Escherichia sp., P.

fluorescens, Azotobacter sp., Alcaligenes sp. y P. putida han observado que el crecimiento no es verdaderamente logarítmico cuando se utiliza glifosato como fuente de fósforo o carbono (Sun etal., 2005; Moneke et al., 2010), lo cual se asemeja a las curvas de crecimiento presentadas por las bacterias escogidas en esta investigación.
Antagonismo. Al enfrentar la bacteria P. aeruginosa con B. gladioli se presentó un halo de inhibición de 0,4 cm y con F. oryzihabitans 0,45 cm. Al mismo tiempo, al enfrentar B. gladioli con P. aeruginosa se observó la presencia de un halo de 0,3 cm. En el caso de la bacteria F. oryzihabitans al enfrentarse con P. aeruginosa mostró un halo de inhibición de 0,4 cm. P. fluorescens no presento antagonismo con ninguna de las bacterias ensayadas. Tomando como referencia estos resultados se pudieron realizar las siguientes mezclas: F. oryzihabitans + P. fluorescens + B. gladioli y P. fluorescens + P. aeruginosa. Esta prueba por lo tanto dio lugar a la formación de dos consorcios para realizar las cromatografías y las pruebas de toxicidad.
Toxicidad. En la prueba de toxicidad todas las bacterias arrojaron patrones diferentes de resistencia al compuesto con crecimientos en los medios que contenían hasta un 10 % de glifosato en el caso de P. aeruginosa, 2 % para P. fluorescens y B. gladioli y 0.25 % en el caso de F.oryzihabitans. Los consorcios mostraron una mejor resistencia con crecimientos hasta 20 o 30 % del herbicida para B. gladioli + F. oryzihabitans + P. fluorescens y P. fluorescens + P. aeruginosa, respectivamente. La importancia funcional de las asociaciones en consorcios se demuestra por la capacidad de resistencia a altas dosis de sustancias químicas, donde los microorganismos que conforman el consorcio actúan benéficamente entre sí para tolerar diferentes concentraciones de los compuestos y metabolizarlos (Gao et al., 2006; Romero et al., 2006), lo cual podría ser la explicación de la resistencia de los dos consorcios bacterianos evaluados en esta investigación. En algunos suelos con aplicación frecuente de glifosato se observan cambios en la diversidad microbiana con predominio de algunos grupos funcionales que interactúan entre sí para metabolizar el herbicida (Krzysko-Lupicka y Sudol, 2008; Lupwayi et al., 2009)

La sensibilidad o tolerancia al glifosato está dada por la expresión de las enzimas Aro A clase I o II respectivamente; sin embargo, en suelos contaminados con glifosato en China se encontró un nueva enzima altamente tolerante a este herbicida que no pertenece ni a la clase I o II en Pseudomonas putida que creció en 200 mM glifosato. Este hallazgo es altamente potencial por su posible uso para la generación de cultivos transgénicos resistentes al herbicida (Sun et al., 2005).

Con base en esto se deberían seguir investigando algunas de las especies de Pseudomonas aisladas en este estudio a nivel genético, como promisorias por su alta tolerancia al Roundup SL.
Medida de hidrofobicidad. En la prueba de hidrofobicidad, las bacterias P. aeruginosa, B. gladioli, P. fluorescens y F. oryzihabitans presentaron una tenue coloración con el compuesto violeta de genciana en la línea por la cual corrió la bacteria, no existiendo adherencia a la superficie del polietileno (Figura 3) Esto demuestra que las bacterias estudiadas prefieren compuestos hidrofílicos (Carrillo et al., 1998) como lo es el glifosato. El potencial de hidrofobicidad esta correlacionado con la estructura de los microorganismos teniendo influencia sobre mecanismos de adhesión a diferentes sustancias, aunque la adsorción diferencial no depende tan solo de un factor, sino es un mecanismo complejo donde actúan otras variables que van a determinar esta adsorción (Drozd y Schwartzbrod, 1996; Kaczorek et al., 2008)


Figura 3. Prueba de adherencia al polietileno de P. fluorescens, utilizando como control positivo albúmina bovina.
Cromatografía. Los procedimientos de cromatografía realizados con el revelador ninhidrina, dieron un valor Rf de 0,63 para el glifosato (Figura 4)



Figura 4. Mancha obtenida al correr el patrón de glifosato en cromatografía de papel y revelar con ninhidrina.
A las 264 horas se observan diferencias significativas en los porcentajes de degradación (P= 0,004), siendo los mejores tratamientos de acuerdo a la prueba de Rango Múltiple de Duncan P. fluorescens (59,2%), P. aeruginosa + P. fluorescens (56,7%) y P. fluorescens + Flavimonasoryzihabitans + Burkholderia gladioli (51,9%) (Figura 5)



Figura 5. Porcentajes de degradación de glifosato por P. aeruginosa, B. gladioli, P. fluorescens, F. oryzihabitans y las mezclas.
En estudios posteriores de biorremediación de este herbicida a altas concentraciones, sería aconsejable ensayar los consorcios bacterianos ya que crecieron con concentraciones de glifosato de 20 y 30 %, mientras que P. fluorescens sólo tolero un 2 % del compuesto; demostrando la existencia de sinergismo entre las bacterias para potenciar su acción degradadora. En biorremediación se busca que el crecimiento bacteriano se obtenga en menor tiempo y que alcance un porcentaje de degradación alto (Ron, 2006; Natarajan, 2008; Moneke et al., 2010)

Está bien documentado que bacterias del suelo degradan el glifosato; sin embargo, esta capacidad se puede ver limitada por la baja permeabilidad de la célula bacteriana al glifosato, pH, mecanismos de sorción y por la disponiblidad de fosforo inorgánico (Obojska et al., 2002; Sorensen et al., 2006; Cuervo, 2007; Forlani et al., 2008; Zablotowicz et al., 2009; Wiersema et al., 2011) Un ejemplo de la capacidad degradadora de los microorganismos del suelo fue la encontrada por Shushkova et al. (2009), utilizando la bacteria Ochrobactum anthropi GPK3, la cual redujo la concentración de glifosato en un 25,4%, en un suelo con un contenido del 1 % de carbono orgánico y 39 % de arcilla. En el 2010 se adiciono esta bacteria junto con Achromobacter sp. Kg 16 a un suelo contaminado con glifosato a una concentración 10 veces mayor que la dosis recomendada para erradicación de malezas, observando entre 1 a 2 semanas después de la introducción de las bacterias una disminución del contenido de glifosato y de la toxicidad del suelo a valores de suelo no contaminado (Ermakova et al., 2010) Esta propiedad también fue comprobada en ésta investigación donde bacterias nativas aisladas de suelos dedicados a actividades agropecuarias en Cundinamarca y mezclas entre ellas mostraron diferentes porcentajes de degradación del herbicida evidenciando la utilización de glifosato como fuente de carbono durante el tiempo evaluado.

ENSAYO EXPLORATORIO DE MICROORGANISMOS NATIVOS ÚTILES PARA LA BIODEGRADACIÓN DE GLIFOSATO EN CULTIVOS DE PALMA DE ACEITE
METODOLOGÍA:

Las muestras provinieron de una plantación de la zona occidental, la cual fue erradicada mediante método químico de glifosato y monocrótofos.

Se tomaron 3 muestras en total, las cuales incluyeron:

  • Muestras de suelo

  • Muestras de tejido de palma

  • Muestras de detritos, acumuladas en las bases de las hojas.

Aunque en los ensayos se realizaron por duplicado para cada una de las muestras, el muestro no fue sistemático y simplemente se basó en la observación de una palma erradicad. Así los resultados presentados se constituyen en un estudio d caso.
EVALUCION DE LA MICROBIOTA INICIAL DEL SUELO

Se mezclaron 50g de cada una de las muestras con 50ml del Medio Mínimo Salino (MMS).

Se agitó durante una hora a 150rpm y se dejó reposar.

Posteriormente se realizaron diluciones seriadas a partir del sobrenadante y se hizo recuento en placa de unidades formadoras de colonia de hongos y bacterias.

Para bacterias:

Se empleó el medio enriquecido Luria-Bertani compuesto por triptona, extracto de lavadura, NaCl y agar bacteriológico.

Para hongos:

Se utilizó el medio agar malta, extracto de malta, agar y cloranfenicol.

Las placas se incubaron a 30°C durante 48horas.

Estrategia de recuentos:

Se basó en recuentos de baterías y hongos tolerantes a diferentes concentraciones de glifosato, mientras crecían en cultivos mixtos. Este procedimiento se llevó a cabo, suplementando el MMS que contenía la muestra con 100mg/l de glifosato y glucosa al 2%.

Luego el medio incubo durante 8 días a 30°C. al cabo de este tiempo se tomó el volumen de 2.5ml del cultivo crecido y se inoculo a 50ml de MMS que contenía una mayor concentración de glifosato y se incubo en iguales condiciones.

Lo anterior se realizó sucesivamente durante un periodo de mes y medio empleando las siguientes concentraciones de glifosato: 100, 500, 1000, 1250, 1500 y 2000mg/L.

Para la recuperación de hongos presentes en la muestra al medo propuesto se le agrego 0.5ml de una solución de antibióticos compuesta por ampicilina y cloranfenicol. A medida iba aumentando la concentración de glifosato, se realizaron recuentos de microorganismos, lo cual se llevó a cabo en placas de agar de MMS o MMS + Ab (para bacterias y hongos respectivamente), adicionando al medio glifosato a una concentración igual a la que encontraba el medio líquido.

Estrategia de aislamientos:

Se aislaron los morfotipos de microorganismo obtenidos en una concentración se 10mg/L , una vez se obtuvieron cultivos puros tanto para hongos como para bacterias, se inocularon cada uno de los microorganismo individualmente en 10ml de MMS con 500mg/L de glifosato.

Estos cultivos de incubaron a 30°C y 150 rpm durante 8dias. Al cabo de este tiempo se transfirió 10% de cultivo crecido a un medio fresco con mayor concentración de herbicida, así se realizó sucesivamente con concentraciones de 1000, 1250, 1500 y 2000 mg/L de glifosato. En cada uno de los pases se determinó el crecimiento bacteriano por medio de recuento de placas y medida de absorbancia a una longitud de onda de 600nmen el medio crecido. La evaluación de crecimiento fúngico se llevó a cabo de forma cualitativa denotando los parámetros de abundante crecimiento, crecimiento moderado, escaso crecimiento y crecimiento nulo.
RESULTADOS:

Los recuentos obtenidos tanto para hongos como para bacterias mostraron ser elevados. Los recuentos obtenidos en cultivos mixtos mostraron un comportamiento variable en el crecimiento bacteriano a medida que aumento la concentración de glifosato. Este resultado demuestra que cuando las bacterias crecen e cultivos mixtos son capaces de sobrevivir y posiblemente metabolizar el medio con glifosato. Sin embargo, los ensayos con cultivos diferentes morfotipos aislados mostraron que únicamente cinco morfotipos sobrevivieron a la concentración mayor de glifosato. La anterior indica que posiblemente las bacterias puedan metabolizar glifosato solo cuando crecen en consorcio.
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