|
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRÁN
|
MACROPROCESO DE RECURSOS E INFRAESTRUCTURA ACADÉMICA
|
FORMATO PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO
|
Fecha: Abril de 2011
|
Código: GRL-006
|
Versión: 4.0
|
INFORME DE LABORATORIO PRÁCTICA N°2 | NOMBRE DE LA PRÁCTICA:
Medición de Viables o Diluciones Seriadas
| PRÁCTICA No.:2
|
ASIGNATURA:
BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL
|
INTEGRANTES DEL GRUPO
Lina María Rodríguez COD 1015438792
Daniela Ortiz Castillo COD
María Juliana Barbosa COD
Jorge Uriel Méndez COD
| |
CONTENIDO DE LA GUÍA
|
OBJETIVOS
Objetivo general
Medir el crecimiento microbiano de la cepa Pseudomona sp a través de diluciones seriadas en diferentes medios de cultivo.
Objetivos específicos
Realizar diluciones seriadas a partir de un cultivo madre de Pseudomona Sp a diferentes concentraciones.
Evaluar la capacidad de crecimiento microbiano de la Pseudomona Sp utilizando la siembra en placa en diferente medio de cultivo.CUAL PESTICIDA
RELACIONAR Determinar la población del medio de cultivo y cantidad de colonias a través del método de densidad óptica y recuento en placa.
|
INTRODUCCIÓN
JUSTIFICACIÓN
Con esta práctica se pretende analizar el crecimiento bacteriano con agar nutritivo y pesticida, observando como la bacteria (Pseudomona) es más resistente a un agar que al otro también este tipo de prácticas nos sirven mucho para aprender a hacer recuento, con las diluciones seriadas tener datos más exactos del conteo de dichas bacterias, mirar su comportamiento en el momento del crecimiento e identificar sus características de forma y tamaño.
Las pseudomonas son bacterias que sirven para la biorremediacion de suelos que han sido afectados por pesticidas ya que tienen la habilidad de usar diferentes substratos teniendo en cuenta también los que son creados por el petróleo y sus derivados, es decir son productoras de biosurfactantes. La poca resistencia que adquiere la bacteria a los pesticidas puede ser factor de dos cosas la primera es que es un buen indicio puesto que entre menos crezcan las bacterias, va a ver menos utilidad de pesticidas en cultivos, y al disminuir el uso de estos se disminuye la problemática en la salud humana; o la otra es que el pesticida tenga mucha concentración de químicos y por eso no haya crecido en la bacteria. En el agar nutritivo se esperaba crecimiento ya que la caracterización de este agar es que crezca todo tipo de bacterias ese es su propósito pues es como una base para los demás agares
|
MARCO TEORICO
Concentraciones ¿Que son y para qué sirven?
Desde la perspectiva química y biológica, la concentración, describe la relación que existe entre el soluto (que es la sustancia que es capaz de disolverse) y el disolvente. Para saber exactamente la cantidad de soluto y de solvente de una disolución se utiliza una magnitud denominada concentración. (Profesor en linea , 2014).
Dependiendo de su concentración, las disoluciones se clasifican en diluidas, concentradas, saturadas y sobresaturadas.
Descripción de una solución, (Trujillo, 2004), Soluciones acuosas, Quimica General
La concentración de un soluto es una propiedad intensiva y es una característica importante de cualquier tipo de solución, desde el punto de vista analítico para la química, como ambiental. En el ámbito ambiental, es de vital importancia conocer la concentraciones de contaminantes, tanto en aire, agua o suelo, y así conocer por medio de este su toxicidad. , (Trujillo, 2004).
La concentración se puede clasificar en cualitativa y cuantitativa respectivamente: , (Trujillo, 2004).
Concentración cualitativa (Trujillo, 2004). ( Mayor o menor concentración) :
Diluidas Saturadas
Concentradas Sobresaturadas
Concentración cuantitativa (Trujillo, 2004). ( Modo de expresarse)
Partes por millón ( billón , porcentaje peso a peso) Moralidad
Molaridad Fracción molar Normalidad
La utilidad de los cálculos de concentración y las respectivas formas de expresarlos cuantitativamente, nos permite dominar muchos de los sistemas de soluciones y a su vez entender la relación con sus propiedades físicas, químicas y biológicas. (Escuela de KINESIOLOGIA, 2007).
La importancia de conocer sobre las concentraciones, nos permite cuantificar una solución madre, y está estrechamente relacionada con las diluciones, a partir de las concentraciones surgen estas, y; a su vez nos permite identificar la cantidad en la que esta una cepa de un microorganismo y como esta, en mayor o menor concentración responde a diferentes condiciones físicas químicas y ambientales.
En el laboratorio las concentraciones son un método eficaz, para la obtención de resultados con respecto a la cantidad evaluada, las cantidades a utilizar de soluciones, a través de esta se puede hallar concentraciones iniciales de una solución madre, y así reconocer en qué estado o cantidad parte en la solución para otras. (Trujillo, 2004)
DILUCIONES SERIADAS
Figura 2. Preparación de las diluciones
Fuente: Tortora et al. 2007
Al acto de preparar diluciones se le llama diluir. (Ayala, 2015). Como consecuencia de esto la concentracion va a cambiar, vamos a tener la misma cantidad de soluto pero en mas disolvente. Para este proceso se necesitara entonces saber el volumen a tomar de solucion madre, y por supuesto el volumen final al que queremos llegar.
Este procedimiento esta dada por etapas a seguir (Ayala, 2015) :
Se calcula la cantidad de volumen final al que se necesita llegar
Se calcula el volumen inicial
Se añade poco a poco la concentracion hasta llegar al volumen deseado.
Factor de dilución (Ayala, 2015)
Este se expresa en terminos de volumen. Esta dada por el volumen que hay que añadir de la solución madre en razon o sobre el volumen final de la dilución. Asi por ejemplo tendremos un factor de dilucion de 1:2 , en lo que quiere decir 1ml de disolución mayor concentrada con 1 ml de solvente en razon de 2ml.
Las diluciones seriadas son diluciones que se preparan apartir de una solucion madre, diluyendo esa concentracion a concentraciones mas pequeñas(Brock, T, 1996)..
Las diluciones son comúnmente expresadas como una unidad de la solución siendo diluido el número total de unidades de la solución final. Por ejemplo 1ml de la solución es adicionado a 9ml del diluyente es decir 1:10 ó 1/10 (se lee 1 en 10) El factor de dilución es una medida del grado en el que una solución ha sido atenuada, este valor se puede calcular dividiendo el volumen final obtenido/volumen de la alícuota. (Brock, T, 1996).
Las diluciones seriadas se pueden encontrar en diferentes campos de la ciencia como biología, microbiológica, biotecnología, química entre muchas más, ya que en algunos casos se necesita de cantidades muy pequeñas de sustancias para experimentos, así que este procesos nos permite realizar esto a partir de soluciones madre o soluciones llamadas stock.
Las diluciones seriadas son importantes en el area de microbiologia, porque gracias a estas se permite hacer aislamientos de microorganismos apartir de poblaciones densas y a su vez calcular la cantidad aproximada de estos en una muestra, comunmente casi nunca encontramos microorganismos asilados, este tipo de tecnicas nos permite realizar aislamientos, en poblaciones mixtas. (Brock, T, 1996).
|
En el campo de la biotecnologia son una herramienta util para reconocer y entender el comportamiento de los microorganismo, su forma de crecimiento en diferentes medios, para lograr utilizar este tipo de microorganimos para las distintas problemática ambientales en cuanto a manejo de contaminantes, dado a que se hacen a distintas concentraciones, esto con el fin de saber la capacidad degradativay los posibles factores ambientales y fisicos a los que se ven enfrentados para reducir y o ampliar su poder de crecimiento y estabilidad en un medio de cultivo. (Brock, T, 1996).
GENERO PSEUDOMONA SP
Es un grupo muy diverso cuya taxonomía se ha simplificado. Son microrganismos ubicuos (microorganismos que pueden estar en cualquier lugar: en el agua, en el suelo o en el aire), son bacilos gramnegativo aerobios. Su forma es recta y curvada con flagelación polar, son capaces de degradas distintos compuestos, sin embargo no pueden degradas polímeros o monómeros. Son de carácter mesófilo, poseen mega plásmidos degenerativos, en donde se encuentran los genes para la degradación de distintos compuestos. Las bacterias de este género se encuentran en suelos, aguas y ambiente. Son altamente resistentes a los antibióticos lo que los vuelve de cierta forma peligrosos para el ser humano, al ser patógenos. (Academia.edu, 2014)
(Academia.edu, 2014)G
enero Pseudomona Sp
Generalidades y características de la PSEUDOMONA SP
Son bacilos gramnegativos en donde se pueden encontrar tanto rectos como curvos. Cuando son aislados pueden aparecer en cadenas o pares respectivamente. Algunos de ellos poseen micro cápsulas y pigmentos que son solubles en agua. Estos pigmentos tienen la función de capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo del microorganismo Utilizan compuestos orgánicos en descomposición y tienen un papel fundamental en la degradación de estos mismos. Este tipo de microorganismos crecen en medios simples. Tienen una temperatura de crecimiento óptima de 36°C. En caldo crecen en grandes cantidades formando un anillo de color verde azulado. En agar simple forman colonias brillantes, de borde continuo o a veces ondulado con un centro opaco. (Academia.edu, 2014).
Su metabolismo es siempre respiratorio, esto quiere decir aerobio, pero hay ciertos casos en donde se presentan como anaerobio, algunos usan NO-. Estos microorganismos presentan una actividad metabolica especil y versatil, tiene la capacidad de utilizar como fuente de carbono distintos sustratos. Un ejemplo de esto es la especie Ps Cepacia que utiliza como nutriente mas de 100 compuestos quimicos diferentes y tambien algunos microorganimos quimiolitotrofo que usan agua y CO como donador de electrones. (Unavarra, 2014).
Medio de aislamiento para Pseudomona sp
(Gualoto ,2014, Medio de asilamiento)
No fermentan la glucosa. La forma en que asimilin azucares este tipo de microorganismo esta dada por la via de Etner-Doudoroff ( ruta metabolica que cataliza glucosa o piruvato son enzimas inusuales), y a su vez disponen de un ciclo de Acidos Tricarboxilicos. Algunas especies de este genero (p.ej. Ps. aeruginosa), realizan procesos de desnitrificacion (reduccion asimilatoria del nitrogeno). Es importante destacar que este genero se caracteriza por sus procesos metabolicos variados, y a sus distintas sintesis de enzimas capaces de catabolizar compuestos presentes en el medio, categorizandolas como digestores aerobios de materiales animal y vegetal, impulsando al reciclaje biologico de materia organica. (Unavarra, 2014).
IMPORTANCIA AMBIENTAL Y BIOTECNOLÓGICA.
Debido a su variedad de procesos metabólicos, las Pseudomonas, tienen una gran importancia y utilidad para el tratamiento de contaminación ambiental debido a acumulación de metales pesados y compuestos xenobioticos. Estos microorganismos poseen estructuras (plásmidos) que son capaces de degradar total o parcialmente compuestos orgánicos derivados del petróleo y órgano clorados-Fosfatados. La selección adecuada de estas cepas, permiten reducir estos niveles de compuestos xenobioticos. También es útil en la biodegradación de hidrocarburos y compuestos orgánicos dependiente de la estructura del hidrocarburo en cuestión. Como se mencionaba inicialmente este tipo de microorganismos son útiles para el manejo de contaminación por metales pesados. Algunas bacterias de este género, presentan en su estructura enzimas capaces de reducir cationes metálicos en formas neutras, bajando el contenido de toxicidad. También existe otro tipo de especies capaces de acumular metales pesados y formarlos en cantidades grandes para hacer una precipitación por floculación, algunas de esta especie son Zooglea. (Unavarra, 2014).
MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS A UTILIZAR
Materiales y Equipos
|
Reactivos
|
Materiales Estudiante
|
Erlenmeyer (1)
|
200ml Agua Peptonada al 0.1% (para 4 grupos)
|
Bata, gafas, guantes, tapabocas por estudiante.
|
Pipeteador automático y
puntas estériles para 1 ml.
(1 por grupo-10 grupos)
|
15 ml de Caldo Nutritivo con
cultivo bacteriano
(Pseudomona sp.)
|
|
Pipeteador (1 por grupo-10
En total).
|
Agua destilada
|
|
Pipetas de 2ml, 5ml, 10ml estériles (1 por grupo-
10 en total)
|
Cajas de petri con agar nutritivo
(4 por grupo- 10 grupos)
|
|
Tubos de ensayo (5 por
Grupo-10 grupos)
|
Cajas de Petri con Agar gasolina debidamente esterilizadas (4 por grupo- 10 grupos)
|
|
Gradillas para tubo de
ensayo (1 por grupo-10 grupos)
|
|
|
Asas curvas para siembra (1 por grupo-10 grupos).
|
|
|
Espectrofotómetro (1)
|
|
|
Celdas esterilizadas.
|
|
|
METODOLOGIA
Preparación de disoluciones seriadas y siembra en placa
(Biotechnologies UMB, 2015, Lab2)
Determinación de población por densidad óptica
(Biotechnologies UMB, 2015, Lab2)
.
|
|
|
|
Preparación de diluciones seriadas y siembre en placa
Realice diluciones sucesivas sin olvidar trabajar siempre junto al mechero. Con una pipeta estéril de 2ml tome 1ml de la solución madre o caldo nutritivo con el cultivo denso de Pseudomona sp inicial y transfiéralo a un tubo con 9ml de agua peptonada al 0.1%, de esta manera usted obtendrá la primera dilución 10-1, tome otra pipeta estéril y transfiera 0.1ml del tubo de la dilución 10-1 al agar proporcionado (Agar nutritivo y agar Petróleo) y distribuya con un asa curva la muestra de manera uniforme sobre la superficie de los agares de manera independiente, utilizando la misma pipeta, transfiera 1ml de la dilución 10-1 a otro tubo con 9ml de solución salina ó agua peptonada al 0.1% obteniendo la dilución 10-2 ; utilice otra pipeta estéril y realice el mismo procedimiento hasta realizar la dilución 10-4.
1 ml
1 ml
 
9 ml
9 ml
Incube las cajas de agar nutritivo y de petróleo en posición invertida, durante 24-48h, a 37ºC.
Determinación de población por densidad óptica
La densidad óptica de un medio de cultivo es proporcional a la masa celular ó a la población microbiana. Éste método se basa en la ley de Beer y Lambert y en este caso se asume que la absorción del rayo incidente es proporcional a la concentración de células presentes (Martínez, 1990). Después de haber realizado las siembras realice las mediciones espectrofotométricas de cada una de las diluciones realizadas. Con ayuda del espectrofotómetro realice la medición de absorbancia correspondiente a cada una de las diluciones realizadas y realice la gráfica. Determine la absorbancia a 540nm de las diluciones obtenidas utilizando como blanco el medio de cultivo sin inocular.
Recuento en placa
A partir del número de colonias de Pseudomonas presentes en el agar petróleo sembrado con la dilución 10-1, dilución 10-2, dilución –3 y dilución 10-4 calcule la población en cada una de las diluciones realizadas informando en UFC/ml. Éste cálculo se realiza multiplicando el número de colonias obtenido en cada caja por el inverso de la dilución.
Ejemplo: Usted obtuvo 15 colonias en la dilución 10-3 el número de UFC/ml será igual a:
15 x 1000 = 15000 UFC/ml ó 1.5 x 104 UFC/ml
Sabiendo que se cuenta el número de colonias y se multiplica por el inverso de la dilución y después se multiplica por 10 (ajuste del volumen inoculado) para obtener el número de UFC/ml de la muestra original.
-
Técnica
|
Dilución sembrada
|
Número de Colonias en el agar
|
UFC/ml por dilución
|
|
10-1
|
|
|
|
10-2
|
|
|
|
10-3
|
|
|
|
10-4
|
|
|
Medición Espectrofotométrica:
-
DILUCIÓN
|
VALOR ABSORBANCIA A 540nm
|
10-1
|
|
10-2
|
|
10-3
|
|
10-4
|
|
Realice una gráfica con los datos obtenidos Absorbancia vs Número de células
Recuerde revisar las cajas de petri con el agar gasolina y el crecimiento del microorganismos.
|
BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA.
• ALFONSO AVILA, Nury. Principios Básicos para la Gestión Ambiental. Bogotá: Arfo Editores, 2001.
• ALCALDIA LOCAL DE KENNEDY. Los Humedales. Bogotá: Jardín Botánico, 1999.
• Madigan, M. Martinko, J. Parker, J. 1998. Biología de los microorganismos Brock. Prentice Hall. España.
• MAHECHA VEGA, Gilberto. Fundamentos y Metodología para la Identificación de Plantas. Bogotá: Lerner, 1997.
• PIZANO DE MARQUEZ, Marta. Floricultura y Medio Ambiente: La Experiencia en Colombia. Bogotá: HortiTécnica Ltda., 1997.
• Rittman, B. McCarty, P. 2001. Biotecnología del medio ambiente. Mc Graw Hill. España.
Scraag, A. 1997. Biotecnología para ingenieros, sistemas en procesos tecnológicos. Ed. Limusa-Noriega. México
|
ELABORÓ
|
REVISÓ
|
APROBÓ
| |
Firma
Nombre : Monika Echavarria
Fecha: Julio 2015
|
Firma
Nombre : Jenny Alarcón
Fecha: Julio 2015
|
Firma
Nombre :
Fecha:
|
|
|
INFORME DE LABORATORIO
(Para elaborar por el Estudiante)
| ESTUDIANTES:
|
GRUPO:
|
NOTA:
| CARRERA:
|
Formule tres objetivos que desee cumplir con la Práctica de Laboratorio
El estudiante formulará desde su conocimiento los objetivos para la realización de la práctica
|
Elabore un Mapa conceptual del tema a tratar en la Práctica de Laboratorio.
|
RESULTADOS
A partir de los resultados obtenidos se determina el número de colonias por dilución y medio de cultivo a las 24 y 48 horas de sembradas la cepa. Consigne los datos en la siguiente tabla.
-
TIEMPO
|
Concentración 1
|
Concentración 2
|
Concentración 3
|
Concentración 4
|
24
|
|
|
|
|
48
|
|
|
|
|
|
CUESTIONARIO
Se observa que las Pseudomonas consumen la gasolina o el pesticida?
Consulte las rutas metabólicas utilizadas por los microorganismos para la degradación de hidrocarburos alifáticos y aromáticos.
Consulte las rutas metabólicas utilizadas por los microorganismos para la degradación de pesticidas.
Consulte otras técnicas para el conteo de poblaciones de microorganismos.
|
CAUSAS DE ERROR Y ACCIONES PARA OBTENER MEJORES RESULTADOS:
|
CONCLUSIONES
El estudiante realizara una serie enunciados que respondan a los objetivos que el mismo formuló, basados en el desarrollo de la práctica.
|
APLICACIÓN PROFESIONAL DE LA PRÁCTICA REALIZADA
|
BIBLIOGRAFIA
|
http://www.profesorenlinea.cl/Quimica/Disoluciones_quimicas.html
http://www.equiposylaboratorio.com/sitio/contenidos_mo.php?it=3020
https://books.google.com.co/books?id=FjkH2LJtHaoC&printsec=frontcover&hl=es#v=onepage&q&f=false
BROCK, T. (1996). Microbiología 8ª. Ed. Prentice may. New Jersey.
|
http://www.academia.edu/3641260/Pseudomona
http://es.slideshare.net/MiguelGualoto/biorremediacin-14939016 |
