Resumen el término dna recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de dna que no se encuentran juntas de manera natural.




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títuloResumen el término dna recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de dna que no se encuentran juntas de manera natural.
fecha de publicación18.01.2016
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UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CIUDAD JUÁREZ DIVISIÓN MULTIDISCIPLINARIA CAMPUS NUEVO CASAS GRANDES

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

BACTERIOLOGÍA

DR. ALFONSO GALICIA GONZÁLEZ

ALUMNOS

ERIKA DIANA CANO LÓPEZ

VICTOR JAVIER RAMÍREZ GARCÍA

RAFAEL MARTÍNEZ YAÑEZ

TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE

RESUMEN

El término DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso genético de la recombinación produce DNA recombinante, este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.

Esto nos permite una manipulación e inserción en otro diferente. De esta manera podemos hacer que un organismo animal, vegetal, bacteria, hongo o u virus produzca una proteína que le sea totalmente extraña.

El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de DNA específicos, incluyendo genes.

Existen unas enzimas de restricción, estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucléico invasor, y se denominan según el organismo en el que se descubrieron, la enzima EcoRI proviene de Escherichia coli.

INTRODICCIÓN

ADN es la abreviatura del ácido desoxirribonucleico. Constituye el material genético de los organismos. Es el componente químico primario de los cromosomas y el material del que los genes están formados. En las bacterias y otros organismos unicelulares, el ADN está distribuido por la célula. En organismos más complejos tal como plantas, anímales y otros organismos multicelulares, la mayoría del ADN reside en el núcleo celular.

Los azúcares y los ácidos fosfóricos se unen lineal y alternativamente, formando dos largas cadenas que se enrollan en hélice. Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior de esta doble hélice y forman una estructura similar a los peldaños de una escalera. Se unen a las cadenas mediante un enlace con los azúcares. Cada peldaño está formado por la unión de dos bases, formando los pares de bases anteriormente mencionados; pero estos emparejamientos sólo pueden darse entre la adenina y la timina o entre la citosina y la guanina. Las secuencias el orden en que se van poniendo- que forman adenina, timina, citosina y guanina a lo largo de la cadena de ADN es lo que determina las instrucciones biológicas que contiene.

Desde los años 40´s hay técnicas que permiten determinar la composición de bases del DNA, y en los 70´s se desarrollaron métodos más eficientes de secuenciación.

La ingeniería genética se ha convertido en una de las herramientas más poderosas en la bioquímica moderna y la biología. La Tecnología del ADN recombinante se utiliza ampliamente en la investigación y la industria. Esta tecnología históricamente ha utilizado el organismo Escherichia coli, que es un microbio intestinal de origen natural. Algunos E. cepas de E. coli no sólo contiene el ADN genómico que codifica la información necesaria para el crecimiento y la reproducción, sino tambien realizar pequeñas replicación autónoma de moléculas de ADN circulares llamadas plásmidos.

TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE

En cierto sentido, la caracterización definitiva de un segmento de DNA clonado es la determinación de su secuencia de nucleótidos. La capacidad de secuenciar DNA clonado ha permitido grandes avances en el conocimiento de la estructura génica y de los mecanismos de regulación. Aunque desde la década de los 40 hay técnicas que permiten determinar la composición de bases del DNA, fue en la década de los 60 cuando se desarrollaron los métodos para determinar la secuencia de los nucleótidos. En 1965, Robert Holley determinó la secuencia de una molécula de tRNA que contenía 74 nucleótidos. Se necesitó un año de esfuerzo para realizar este trabajo. En la década de los 70 se desarrollaron métodos más eficientes de secuenciación y, actualmente, en un laboratorio de Biología Molecular, es posible secuenciar más de 1.000 bases en una semana.

El término DNA recombinante hace referencia a la creación de nuevas combinaciones de segmentos o de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso genético de la recombinación produce DNA recombinante, este término se reserva a las moléculas de DNA producidas por la unión de segmentos que provienen de diferentes fuentes biológicas.
La tecnología del DNA recombinante utiliza técnicas que provienen de la bioquímica de los ácidos nucleicos unidas a metodologías genéricas desarrolladas originalmente para la investigación de bacterias y de virus. La utilización del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias específicas de DNA a partir de una población de secuencias mezcladas.
Los procedimientos básicos incluyen una serie de pasos:


  1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restricción, que reconocen y cortan las moléculas de DNA por secuencias nucleotídicas específicas.

  2. Los fragmentos producidos mediante la digestión con enzimas de restricción se unen a otras moléculas de DNA que sirven de vectores. Los vectores pueden replicarse autónomamente en una célula huésped y facilitan la manipulación de la molécula de DNA recombinante recién creada.

  3. La molécula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se transfiere a una célula huésped. Dentro de esta célula, la molécula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas de copias idénticas conocidas como “clones”.

  4. Al replicarse las células huésped, las células descendientes heredan el DNA recombinante, creándose una población de células idénticas, que llevan todas la secuencia clonada.

  5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las células huésped, purificarse y analizarse.

  6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto génico puede aislarse y examinarse.


El desarrollo de las técnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la investigación, ya que simplifica la obtención de grandes cantidades de DNA que codifican genes específicos, y facilita las investigaciones de la organización, estructura y expresión génicas.
Esta metodología también ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnológica, que está suministrando un número creciente de productos al mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de DNA específicos, incluyendo genes.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN.

Endonucleasas de restricción. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las infecciones víricas degradando el ácido nucléico invasor. Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos (denominada sitio de restricción) de una molécula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA por esa secuencia.
Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de enzimas de restricción diferentes.

Las enzimas de restricción se denominan según el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema alfanumérico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubrió en Hemophilus influenzae.

Hay dos tipos de enzimas de restricción:


  1. Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posición aleatoria a cierta distancia del sitio de restricción. No se utilizan normalmente en la investigación de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es preciso.

  2. Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia específica y cortan las dos cadenas de la molécula de DNA con absoluta precisión dentro de la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigación de DNA recombinante puesto que cortan en sitios específicos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simétricas (“palindrómicas”).


Las moléculas de ADN producidas mediante la unión de dos o más fragmentos de ADN se denominan moléculas de ADN recombinantes.

VECTORES

Después de unirse a un vector o vehículo de clonación, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una célula huésped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, moléculas de DNA transportadoras. Para servir de vector, una molécula de DNA debe tener unas determinadas características:


  1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.

  2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restricción, presentes sólo una vez en el vector. Estos sitios de restricción se cortan

con una enzima de restricción y se utilizan para insertar segmentos de DNA cortados con la misma enzima.

  1. Debe tener algún marcador de selección (normalmente genes de resistencia a antibióticos o genes de enzimas que la célula huésped no

tiene) para poder distinguir las células huésped que transportan el vector de las que no lo contienen.

  1. El vector de la célula huésped debe ser fácil de recuperar.

Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plásmidos, los bacteriófagos y los cósmidos.
PLASMIDOS

Los plásmidos son moléculas de DNA de doble cadena extra cromosómicas de origen natural que tienen un origen de replicación y que se replican autónomamente en las células bacterianas. Para poder utilizarlos en ingeniería genética, se han modificado o diseñado muchos plásmidos de manera que contengan un número limitado de sitios de restricción y genes de resistencia a antibióticos s específicos.

CROMOSOMAS ARTIFICIALES BACTERIANOS

Para cartografiar y analizar genomas eucarióticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso denominado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es un plásmido que se replica independientemente y que está implicado en la transferencia de información genética durante la conjugación bacteriana. Puesto que los factores F pueden transportar fragmentos del cromosoma bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseñados para que funcionen como vectores de DNA eucariótico. Los vectores BAC tienen los genes de replicación y de número de copias del factor F, e incorporan un marcador de resistencia a un antibiótico.
BIBLIOTECAS DE DNA

Puesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeño, deben construirse muchos clones diferentes para incluir todas las pequeñas porciones del genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas las secuencias genómicas de un sólo individuo se denomina biblioteca. Las bibliotecas clonadas pueden provenir del genoma completo de un individuo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto de genes transcripcionalmente activos en un único tipo celular.
IDENTIFICACION DE SECUENCIAS CLONADAS ESPECÍFICAS

Una biblioteca genómica puede contener varios cientos de miles de clones. El problema ahora es identificar y seleccionar sólo el clon o clones que contienen el gen que nos interesa, y determinar si un clon determinado contiene todo el gen o sólo una parte de él. Hay varias maneras de hacerlo, y la elección depende de las circunstancias y de la información disponible. Los métodos que se describen a continuación utilizan diversos enfoques para encontrar una secuencia específica de DNA en una biblioteca.


RASTREO DE UNA BIBLIOTECA

Para rastrear una biblioteca construida en plásmidos, se hacen crecer los clones en placas de cultivo, formándose cientos o miles de colonias. Se hace una réplica de las colonias de la placa poniendo sobre su superficie un filtro de nitrocelulosa o de nylon, de manera que algunas células bacterianas de las colonias se transfieran al filtro. Éste se trata para lisar las bacterias, se desnaturaliza el DNA de doble cadena que se convierte en cadenas sencillas, y finalmente dichas cadenas se unen al filtro.
PASEO CROMOSÓMICO.

En algunos casos, cuando se conoce la localización aproximada de un gen, es posible clonar dicho gen clonando primero las secuencias vecinas. A menudo, las secuencias vecinas se identifican por análisis de ligamiento. Estas secuencias sirven de punto de partida para el paseo cromosómico, el aislamiento de clones adyacentes de la biblioteca genómica. En un paseo cromosómico, se subclona el fragmento final del DNA clonado, y se utiliza como sonda para recuperar clones solapados de la biblioteca genómica.
MÉTODOS DE ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS CLONADAS.

La identificación y recuperación de secuencias de DNA clonadas específicas es una herramienta poderosa para analizar la estructura y la función de los genes. Las técnicas que se describen en las próximas secciones se utilizan para responder a preguntas experimentales de la organización y de la expresión de las secuencias clonadas.
CONCLUSIÓN

El término DNA recombinante se refiere a la creación de nuevas combinaciones o segmentos de moléculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Estas moléculas provienen de diferentes fuentes biológicas.

En la década de los 40 ya hay técnicas que permiten determinar la composición de bases del DNA, en la década de los 60 se desarrollaron métodos para determinar la secuencia de los nucleótidos, en 1965 se necesitaba un año para realizar este trabajo, en la década de los 70 se desarrollan métodos más eficientes de secuenciación y, actualmente; es posible secuenciar más de 1000 bases en una semana.

El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de segmentos de DNA específicos, incluyendo genes.

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