Programa de Doctorado




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8.- Mecanismos de actuación plaquetarios en los procesos de curación.

La curación de los tejidos dañados conlleva una serie de complejas interacciones entre diferentes grupos celulares que actúan entre sí y con la matriz. Los GFs actúan como mensajeros emitiendo señales que son interpretadas por el organismo para activar diversos procesos que tratan de controlar el daño y mantener la homeostasis. El grado de daño que hayan recibido los tejidos hará que la respuesta mediada por el organismo varíe y se consiga en los mejores casos una “restitutio ad integrum” (recuperación total del estado de salud previo), o tan solo una reparación del daño, con recuperación de la función total o parcial y la formación de un tejido distinto del original (tejido de reparación o cicatricial). El proceso de curación se realiza en tres etapas: inflamación, reparación (proliferación), y remodelado.

Cuando se produce una herida, el proceso de curación comienza con la formación del coágulo plaquetario, se activa la cascada de la coagulación y las plaquetas activadas se degranulan liberando los GFs. El organismo crea una señal de alarma y los primeros días se activan los procesos de inflamación, con la llegada de macrófagos y neutrófilos.

Los macrófagos activos liberan multiples GFs, entre los que encontramos TGF-β, y la isoforma α, PDGF, interleukina I, y FGF. Durante los cinco primeros días comienza la angiogénesis y los procesos de formación de colágeno. PDGF y TGF –β, son los factores de crecimiento más importantes en el lugar de la herida cuando se inicia el proceso de curación. Estos factores de crecimiento favorecen la recolección de células inflamatorias gracias a sus efectos quimiotácticos. Así mismo, favorecen la deposición de matriz y la formación de colágeno iniciada por los fibroblastos y mediada por FGF. En los estadios finales se produce la

epitelización principalmente mediada por EGF aunque también desarrolla un papel importante PDGF.




Isoformas

Células productoras

Función

TGF-β

5 isoformas, β1 y β2 las más investigadas.

Plaquetas, macrófagos, neutrófilos, Stem cells mesenquimales, (MSCs) osteoblastos, matriz ósea.

Quimiotaxis, diferenciación de MSCs, producción de colágeno por osteoblastos, angiogénesis, inhibe la acción de osteoclastos y la reabsorción ósea. Efecto mitogénico en células mesenquimales e inhibe la proliferación en células epiteliales dependiendo de otros GFs.

PDGF

3 isoformas: AA, AB y BB

Principalmente plaquetas, macrófagos, osteoblastos (BB), condrocitos, fibroblastos y c.endoteliales.

Facilita la angiogénesis de forma indirecta (medio de macrófagos que actúan sobre c.endoteliales), quimiotáctico y activador de la inflamación, proliferación de c. mesenquimales, facilita formación de colágeno tipo I.

FGF

2 tipo I y II. La II presenta mayor potencial mitógenico.

Principalmente fibroblastos, macrófagos, osteoblastos, plaquetas y c.endoteliales.

Aumentan la proliferación y diferenciación de osteoblastos y la inhibición de osteoclastos.Proliferación de fibroblastos y producción de fibronectina. Favorece angiogénesis.

IGF

2 tipo I y II

Plaquetas, macrófagos, osteoblastos MSCs y matriz ósea.

Proliferación y diferenciación de las MSCs y de las c. de revestimiento. Formación de osteocalcina, fosfatasa alcalina (ALP) y colágeno tipo I.

VEGF

4 isoformas.

Plaquetas, macrófagos, osteoblastos, y células musculares lisas en hipoxia s/t.

Quimiotaxis y proliferación de células endoteliales. Realiza una hiperpermeabilidad de los vasos. Su acción parece regulada por PDGF y TGF β.

EGF

1 isoforma con gran similitud a TGF por lo que se unen al mismo receptor.

Plaquetas, fibroblastos y c.endoteliales.

Mitogenesis, proapoptosis, migración y diferenciación de c.epiteliales, fibroblastos, c.renales y c. gliales.

Tabla 2 .Factores de crecimiento plaquetarios en PRP

En los procesos de curación ósea, las plaquetas actúan como una fuente exógena de GFs, que estimulan la actividad de las células óseas. En la zona de la herida ósea o fractura, las plaquetas liberan PDGF, TGF-β, y EGF, creando un sistema ideal para la llegada de GFs a la herida. La isoforma de TGF-β1, es la que mayor potencial presenta en la reparación ósea, ya que tanto los condrocitos, como los osteoblastos están enriquecidos con receptores para dicha isoforma. La combinación de TGF- β, EGF y FGF, se ha mostrado óptima para la diferenciación y proliferación de osteoblastos a células progenitoras. De igual manera, PDGF aumenta la acción mitogénica de células stem mesenquimales cuando se añade TGF-β y EGF.

La curación del hueso se produce mediante osteogénesis, osteoinducción y osteoconducción.

La osteogenesis es la capacidad de formar nuevo hueso y está determinada por la existencia de células osteoprogenitoras y precursoras en la zona. La osteoinducción es la habilidad de estimular a las células stem para que se diferencien en células maduras lo que es mediado por GFs como PDGF y TGF-β. La osteoconducción está determinada por la presencia de una matriz que permita la migración celular y vascular y se logra habitualmente mediante injertos 15.

9.- Plasma rico en plaquetas (PRP): formas de obtención.

El uso de PRP fue introducido para su uso en procedimientos de cirugía oral y maxilofacial por Whitman et al en 1997 16. La consistencia líquida del plasma, supuso un inconveniente para su fácil manejo, por lo que desde entonces se ha utilizado principalmente como gel de PRP. Para la conversión a gel de PRP, clásicamente se ha utilizado calcio (fosfato cálcico, gluconato cálcico, cloruro cálcico) y trombina de origen bovino.

La trombina actúa en presencia de Ca, transformando el fibrinógeno en fibrina y activando el factor XIII, lo que lleva a la formación organizada de un coágulo 17.

Los riesgos de tratar con la trombina bovina pasan por la posibilidad de desarrollar anticuerpos contra los factores de la coagulación V y IX pudiendo producir coagulopatías 18. En 2005 Landesberg et al, proponen un método alternativo para la obtención del coágulo de PRP sustituyendo la trombina bovina por un receptor de trombina agonista al péptido 6 (TRAP), para evitar el mencionado riesgo de coagulopatías. Consiguieron un gel de PRP de fácil manejo, con un mayor tiempo de trabajo y con una menor retracción del coágulo 19.

Fufa et al, compararon el uso de trombina bovina con el uso alternativo de colágeno soluble tipo-I. Los análisis mediante ELISA, mostraron mayores niveles de TGF-β, para la activación con la trombina clásica durante los primeros 5 días, obteniéndose unos resultados similares a los 10 días del experimento. La retracción del coágulo se mostró menor al activar PRP con colágeno soluble. El estudio validó el uso de colágeno soluble tipo-I como una alternativa fiable 20.

Semple et al proponen la utilización de un dispositivo comercial portátil de fácil manejo, para la obtención de trombina, el Thrombin Processing Device (TPD; Thermogenesis Corp, Rancho Cordova,CA). Utiliza trombina autóloga con similares resultados al uso de trombina bovina. 21

La utilización de derivados del plasma, es sin embargo anterior. De esta forma antes de tratar las posibilidades terapéuticas del PRP, ya se utilizaban otros productos como los adhesivos de fibrina 22. Las propiedades hemostáticas y adhesivas suponían una gran ventaja en numerosos procesos de cirugía. En 1994 Tayapongsak et al, concluyeron en un estudio experimental (33 muestras, reconstrucciones mandibulares tratadas con gel de fibrina autólogo adhesivo), que la remodelación ósea se adelantaba hasta en un 50% en los casos tratados con la fibrina, ya que esta formaba un sustrato ideal para las células mesenquimales y facilitaba la revascularización y migración de fibroblastos 23. Los geles de plaquetas a diferencia de los adhesivos de fibrina, contienen una mayor concentración de plaquetas y por tanto mayor cantidad de proteínas bioactivas y factores de crecimiento 24.

De forma habitual, el manejo de la sangre y sus derivados ha sido realizado por los bancos de sangre de los diferentes hospitales o centros de salud. La obtención de los derivados plaquetarios, requiere de personal entrenado en manejo de laboratorio y del uso de un aparataje sofisticado y caro. La introducción de los derivados del plasma, como una alternativa cotidiana en los procesos de cirugía, para implementar la curación de tejidos y su relación con la posible mejora de la osteosíntesis, han hecho que las compañías farmacéuticas y casas comerciales traten de facilitar el uso de estos productos a un nivel ambulatorio. Comienzan a comercializarse aparatos de centrifugado más pequeños (microcentrifugadoras) y asequibles para las consultas no asociadas a un ámbito hospitalario, así como numerosos kits de preparación de los concentrados de PRP.

Para la obtención de PRP se necesita:

  • Centrifugadora eléctrica o electrónica (ver tabla 3).

  • Tubos con anticoagulante (citrato, fosfato, dextrosa) y tubos sin anticoagulante.

  • Sistemas de recolección de sangre. Jeringas desechables de 20 o 50 cc.

  • Pipeta automática o jeringa desechable de 10 cc para extraer el plasma.

  • Agentes de mezcla para la formación del gel (trombina bovina 1000 U, cloruro cálcico al 10% TRAP…).

Fases de obtención de PRP:

  1. Obtención de sangre venosa. La obtención de la sangre la realizará el servicio de hematología en ambiente hospitalario, o en su defecto, personal que debe estar cualificado en el ámbito privado. Se obtiene del paciente una cantidad de sangre de entre 20-50 cc, según el defecto que necesitemos tratar. Habitualmente se consigue en PRP, una décima parte del volumen de sangre total. La sangre extraída se coloca en los tubos tratados con anticoagulante (citrato sódico al 3´8%) y se realiza el centrifugado.

  2. Proceso de centrifugado. El proceso de centrifugado es crítico, y debe realizarse con un exhaustivo control de los parámetros. Los equipos digitales facilitan la observación y programación de los mismos. Puede realizarse un centrifugado único o doble. Una primera centrifugación (según autores entre 7- 20 minutos y entre a 1200 -1400 rpm). Se obtiene una diferenciación en fases de los componentes en el tubo. De esta forma los hematíes se quedan en el fondo de color carmesí, y el sobrenadante transparente amarillento está constituido por un suero con plasma bajo o pobre en plaquetas (PPP), del que se puede obtener adhesivo de fibrina. Entre medias de las dos capas se encuentra la franja leucocitaria que contiene la mayor concentración de plaquetas 25. Con la pipeta o la jeringa de 10 cc, se extrae todo el suero y el componente sanguíneo de la franja leucocitaria, que se encuentra 3 mm por debajo de la línea de separación de los sustratos. Pasamos el contenido a los tubos sin tratar. Se realiza un segundo centrifugado (15 min, 2000 rpm) y se obtiene una capa superior más clara con fibrinógeno y una baja concentración de plaquetas y una inferior más concentrada en PRP. Eliminamos la capa superficial y el PRP obtenido, se mezcla con los componentes gelificantes seleccionados.

  3. Procesos de activación y gelificación: El proceso clásico con trombina bovina, en el que se mezclan 6 ml de PRP con 1000 U de trombina bovina y 1 cc de cloruro cálcico durante 60-90 segundos. Tras 5-8 minutos se obtiene el PRP de consistencia gel. Sonnleitner et al, proponen una simplificación del método de activación, utilizando un preparado comercial llamado Tissel. Es un preparado de dos componentes. El primero contiene una alta concentración de fibrinógeno, factor VIII, fibronectina y trazos de otras proteínas plasmáticas, mientras que el segundo componente, lleva trombina, cloruro cálcico, y agentes antifibrinolíticos 26.

Durante los procesos de obtención de PRP, el operador trata de obtener una cantidad de plasma adecuada, con un contaje plaquetario ideal y un gran contenido en factores de crecimiento (GFs), para optimizar su funcionamiento. En los diferentes estudios, se han tratado de encontrar las cantidades y tiempos de manipulación ideales, así como el uso de diversos aditivos con la finalidad de potenciar la capacidad de acción del PRP. Yazawa et al utilizaron sustancias antiplaquetarias (prostaglandinas, PGE1, aspirina…) para tratar de aumentar los GFs durante el proceso de concentración del plasma. Observaron que en las muestras tratadas con sustancias antiplaquetarias se produjo un aumento de hasta el 400 % de PDGF y TGF-β1, concluyendo que el uso de estas sustancias puede aumentar los niveles de GFs 27.

Microcentrifugadoras y aparatos de preparación de PRP.

  • Smart PReP (Harvest Technologies, Norwell, MA), fue el primero introducido en el mercado. Actualmente podemos encontrar el SmartPReP 2 APC+. Imagen derecha inferior.

  • Sistema Curasan. En 1999 lanzan al mercado un sistema para la obtención de factores de crecimiento plaquetarios.

  • Platelet Concentrate Colection System. PCCS (3i, año 2000).

  • Separador celular de densidad gradiente Electromedics 500 (Medtronics).

  • Compact Advanced Platelet Sequestration System (CAPSS).

  • The Plasma Seal (San Francisco, CA).

  • Equipo PRGF para centrifugación y preparación del plasma (GAC Medicale- España).

  • Centrifugadora dual Medigraft. (Surgest Medical). Imagen central e izquierda inferiores.
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