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Estructura del DNA



Los estudios de Watson y Crick y los usos de la técnica de difrac­ción de rayos X, determinaron que la conformación tridimensional del DNA consiste en dos cadenas enrolladas una sobre otra consti­tuyendo una doble hélice.

Las bases están apiladas una sobre otra formando lo que se llama ordenamiento stacking o de apilamiento. La distancia entre una base y otra de la misma cadena es de 3, 4 Å.

Cada una de las cadenas tiene un eje que está formado por las desoxirribosas, que están unidas entre sí por una molécula de fosfato constituyendo un enlace 3' 5' fosfodiéster. Las bases están unidas a la desoxirribosa por medio de una unión covalente.

El eje azúcar-fosfato se encuentra hacia afuera de la molécula y las bases están orientadas hacia adentro de la misma.

La estructura de doble hélice exige que cada base de una cadena se aparee específicamente por medio de enlaces no covalentes (puentes de Hidrógeno) con una base complementaria de la otra cadena.

Figura: Estructura de la doble hélice de ADN

El apareamiento de bases complementarias debe producirse entre una base púrica (con dos anillos) y una pirimidínica (con un solo anillo). El mayor número de puentes de hidrógeno se producen cuando se unen citosina con guanina. Entre estas bases pueden formarse tres enlaces, en cambio entre adenina y timina se forman solo dos, lo que determina que esta unión sea más débil que la anterior.

El diámetro de la doble hélice es constante (20 Å), debido a que se mantiene la misma distancia entre base y base de cada una de las cadenas. (Figura 1).

Bioquímicamente podemos decir que la concentración de purinas es igual a la de pirimidinas, {(A+G) = (C+T)}.

En general los pares de bases están dispuestos en un ángulo de 36° con respecto al par adyacente, por lo tanto hay 10 pares de bases (pb) por cada vuelta de hélice (360°).

Lo más importante en la composición del DNA es la complementarie­dad de bases que es fundamental para la replicación del mismo, ya que por complementariedad se sintetizará una hebra hija a partir de una hebra molde o patrón.


Figura: Bases nitrogenadas, púricas a la izquierda y pirimidínicas a la derecha.



Figura: Enlaces fosfodiéster entre nucléotidos.



Figura 1: Esqueleto azúcar fosfato y apareamiento de bases por comple­mentariedad y su estabilización por puentes de Hidrógeno.
Cada cadena de DNA tiene un extremo 3'-OH y un 5' P. Las cadenas de DNA que forman la doble hélice están orientadas en forma antipara­lela, esto significa:

  • En cada extremo de la doble hélice hay un extremo 3' y uno 5'.

  • La orientación de cada cadena siempre es contraria:

3' ATCGGCTAAT 5'

5' TAGCCGATTA 3'

  • El azúcar de un nucleótido de una de las cadenas está hacia arriba del mismo, mientras que en la cadena complementaria se encuen­tra hacia abajo (Figura 1).

Por convención las secuencias de bases se leen desde el extremo 5' al 3'.

Replicación

Introducción:


Los genes tienen tres funciones principales:

  • Deben ser capaces, por medio de una replicación fiel, de trans­mitir la información genética de generación en generación.

  • Deben contener la información necesaria para elaborar proteínas fundamentales para la célula.

  • Deben aceptar cambios ocasionales como forma de evolución, es decir que pueden mutar.

A pesar que una cadena de DNA es complementaria con la otra, ambas pueden ser separadas y cada una servir de templado o patrón para la síntesis de una nueva cadena. Esto se denomina replicación semicon­servativa, porque cada doble hélice hija tiene una hebra templado y otra hebra de nueva síntesis.(Figura 4)



Figura 4: La replicación del DNA es semiconservativa.

Este modelo de replicación de DNA asume que las nuevas cadenas de DNA se sintetizan siguiendo el usual apareamiento de bases por comple­mentariedad, es decir, A con T y C con G.

Enzimología de la Replicación


La doble hélice de DNA es muy estable en condiciones normales, es por esta razón que las DNA Polimerasas sólo pueden copiar una molécula de DNA en la que se hallan separado las dos cadenas que forman la hélice. Para esto son necesarias proteínas que desestabilicen la doble hélice y pongan al descubierto la hebra patrón que debe ser copiada.

DNA polimerasa


Las enzimas que son capaces de sintetizar nuevas cadenas de DNA se denominan DNA polimerasas.

En procariotas hay tres tipos de polimerasas (I, II, III), sólo una está implicada en la replicación del DNA (ADN polimerasa III), las otras colaboran en la replicación y participan en la reparación. En eucariotas hay cinco tipos de polimerasas. Las DNA polimerasas tienen las siguientes funciones:

  • Polimerizan nucleótidos en dirección 5' 3' (Figura 5).

  • Exonucleotídica: rompe el enlace fosfodiéster, actúa separando los nucleótidos uno a uno desde el extremo de la cadena en creci­miento, en dirección 3' 5'. Es capaz de reconocer los nucleótidos mal apareados durante la replicación. Esta capacidad salvaguarda la fidelidad de la replicación.

Por poseer estas funciones enzimáticas, la DNA polime­rasa no sólo polimeriza nucleótidos sino que también es capaz de corregir los errores factibles de ser cometidos en el proceso replicativo. En eucariotas hay cinco tipos de polimerasas α,β,γ,δ,ε que cumplen distintos tipos de funciones.

DNA Ligasa


Liga los nucleótidos de los extremos 3´ y 5´ de dos fragmentos de DNA contiguos, restituyendo la unión fosfodiéster.

Helicasas o Proteínas de Replicación activadas por ATP


Estas enzimas utilizan la energía del ATP para separar las dos hebras del DNA durante la replicación. Esto se debe a que las helica­sas tienen actividad ATPasa y por lo tanto pueden hidrolizar ATP y utilizar la energía liberada. Hidroliza dos moléculas de ATP por cada par de bases separada.

Proteínas estabilizadoras de la cadena o desestabilizadora de la doble hélice.


Estas proteínas actúan una vez que las cadenas fueron separadas por las helicasas y previenen su reasociación.

Son proteínas de unión cooperativa y se alinean a lo largo de una hebra de DNA extendiéndola y poniendo al descubierto sus bases. También favorecen al proceso de apertura de la hélice. Su presencia es importante para mantener estiradas a las cadenas inestables que se forman en las regiones de DNA cuyas hebras ya hubiesen sido separadas.

Las proteínas estabilizadoras de la cadena se ubican en la mayoría de los segmentos del DNA de una hebra y además desempeñan un papel importante en la reparación del DNA. En procariotas la proteína estabilizadora de la cadena es la SSB (Single Strand Binding) o proteína de unión al DNA de una sola hebra (Figura 6).


Figura 5: Etapas de la reacción catalizada por la DNA polimerasa.

Topoisomerasas


Recordemos que las moléculas de DNA con distintos grados de superenrollamiento se denominan topo isómeros; por lo tanto estas enzimas se denominan topoisomerasas porque tienen la propiedad de convertir un isómero topológico en otro, cortando las hebras de DNA y modifican­do así el superenrollamiento.

Algunas pueden relajar el superenrollamiento negativo, otras ambos tipos y otras introducen superenrollamiento negativo.

Como dijimos antes, durante la replicación al abrirse las cadenas de DNA a medida que avanza la horquilla de replicación, se genera por delante de ella superenrollamiento positivo, con lo cual el DNA se vuelve sobre envuelto (Figura 7). Este problema puede resolverse con las topoisomerasas, las que realizan una incisión de una de las cade­nas, rotación y reunión del corte (Figura 7)

A medida que avanza la horquilla la operación puede volver a repetirse tantas veces como sea necesario.

Un dato interesante es que esta topoisomerasa es inhibida por dos tipos de antibióticos que actúan sobre sus subunidades, inhibiendo la repli­cación bacteriana lo que demuestra que la enzima es fundamental para la síntesis de DNA. Las mutaciones que se den en los genes que codifi­can las subunidades de esta enzima, le confieren a las bacterias mutantes resistencia a los antibióticos.



Figura 6: Proteínas y enzimas que colaboran en la replicación.


Figura 7: Superenrollamiento positivo generado por delante de la horqui­lla de replicación y modo de relajarlo.

En eucariotas aún se sabe poco sobre las topoisomerasas, ya que como vemos han sido estudiadas más en bacterias.

A modo de resumen, digamos que estas enzimas son fundamentales en la replicación, evitando el gran gasto energético que le representaría a la célula hacer girar la molécula de DNA 360° cada 10 pares de bases replicadas. (Figura 8).

RNA Polimerasa o Primasa


Enzima que asociada a la DNA polimerasa es responsable de la síntesis del cebador o primordio de RNA necesario para el inicio de la replicación.



Figura 8: Giro que debería dar la hélice por delante de la horquilla

Mecanismo de la Replicación.


La replicación del ADN en células eucariotas es un proceso complejo con algunos aspectos únicos que la distingue de la replicación en procariotas. Primeramente la síntesis de ADN es compartimentalizada dentro del núcleo y separada del citoplasma, segundo, el cromosoma eucariótico es un complejo de ADN y proteínas con múltiples orígenes de replicación.

Un número creciente de trabajos relacionan la matriz nuclear con la síntesis de ADN. El término matriz nuclear, se aplica a una red filamentosa intranuclear a la cual se asocia la eucromatina y heterocromatina. Esta matriz participaría en el desenrollado de la doble hélice de ADN para permitir el acceso de la maquinaria para la síntesis de ADN y permitir la fácil separación de las hebras hijas

Como se describió previamente, la molécula de ADN es una cadena formada por 2 hebras que se mantienen unidas a través de puentes hidrogeno por complementariedad de bases.

Estas hebras pueden ser separadas y cada una de ellas servir de templado o patrón para la síntesis de una nueva cadena. Este proceso se denomina replicación semiconservativa, porque cada doble hélice hija tiene una hebra templado y otra hebra de nueva síntesis.
Este modelo de replicación de ADN asume que las nuevas cadenas de ADN se sintetizan siguiendo el usual apareamiento de bases por complementariedad, es decir, A con T y C con G.

Ocurre de una manera temporal y espacialmente regulada dentro de las unidades de replicación o replicones (burbujas de replicación), por lo tanto, la iniciación es un proceso altamente coordinado.

En el ADN humano existen del orden de 20.000 a 30.000 sitios y a partir de cada uno de ellos se replican de 100 a 200 kb casi simultáneamente pero en forma secuencial

A continuación se describirá el mecanismo de replicación del ADN que implica una serie de eventos como ser la iniciación, elongación y terminación
Origen de la replicación
Si bien existen diversas teorías para explicar el inicio de la duplicación del ADN, la más aceptada es que la síntesis del ADN en eucariotas superiores se inicia dentro de “zonas de replicación” denominadas replicones o burbujas de replicación que poseen un sitio de inicio y posiblemente uno de terminación. Es realizada por mega complejos de proteínas que se ensamblan coordinados temporalmente durante el ciclo celular y se unen a los orígenes de replicación. Por otra parte, una vez iniciada la replicación, el proceso continúa hasta la replicación total del ADN. Se supone además, que las burbujas de replicación se van formando en un orden secuencial y no todas al mismo tiempo ya que si todos los replicones comenzarían al mismo tiempo la etapa duraría solamente 1 hora en lugar de 4-6 horas.

Los organismos vivos deben duplicar con exactitud su ADN antes de cada división celular, específicamente en la fase S del ciclo celular.

La replicación del ADN implica velocidades de polimerización de 500 nucleótidos por segundo en bacterias y 50 por segundo en mamíferos.

Los análisis autorradiográficos de cromosomas replicados con timidina marcada, revelaron que existe una región concreta de replicación que se desplaza a lo largo de la hélice paterna de ADN. Esta estructura tiene forma de “Y” y se denomina horquilla de replicación del ADN

Cada burbuja da origen a dos horquillas de replicación con sentido opuesto y por lo tanto, la dirección de la síntesis es bidireccional. La regulación de la síntesis de ADN depende de la interacción de una variedad de proteínas como ser, ciclinas, inhibidores de ciclinas, proteínas derivadas de oncogenes y antioncogenes factores de crecimiento etc., que se desarrollara en el capitulo de Mitosis y Meiosis.

Las horquillas de una burbuja de replicación continúan abriéndose hasta que se encuentre con la horquilla adyacente que se desplaza en dirección opuesta. Esto hace difícil poder determinar el punto final de un replicón, como se expreso anteriormente.





Figura 9:Burbujas de replicación

Debido a la orientación antiparalela de las dos hebras, si la replicación fuera un crecimiento continuo de las dos nuevas cadenas, una debería crecer en dirección 5' 3' y la otra en dirección 3' 5'. Esto exigiría la acción de dos DNA polimerasas diferentes. Una debería polimerizar en dirección 5' 3', donde cada monómero entrante transpor­ta la activación del trifosfato que es necesaria para su propia adición (crecimiento por la cola). La otra DNA polimerasa debería trabajar en dirección 3' 5', donde el extremo de la cadena en crecimiento contendría la activación del trifosfato que se requiere para la adición del siguiente nucleótido (crecimiento por la cabeza).

No existe nin­guna DNA polimerasa que actúe en dirección 3' 5'. En­tonces se plantea un interrogante: ¿Cómo se sintetiza el DNA en direc­ción 3' 5'? (Figura 12)

Cuando la hebra patrón presenta la dirección 5' 3', es decir que la dirección de síntesis es 3' 5', ésta se realizará en forma discontinua. Se sintetizan pequeños fragmentos (100 a 200 pb) de DNA denomina­dos Fragmentos de Okazaki en dirección 5' 3', que luego deben ser unidos por la DNA ligasa.

Como la DNA polimerasa no es capaz de iniciar la síntesis a partir de dos mononucleótidos libres, requiere de un pequeño segmento de polinucleótidos cuyas bases estén perfectamente apareadas con las de la hebra patrón, y un extremo OH libre, sobre el cual añadirá nucleó­tidos.

Este pequeño segmento de aproximadamente diez nucleótidos de longitud es un RNA y se denomina RNA cebador, sintetizado en bacterias por una enzima llamada primasa que es una RNA polimerasa.

En el caso de la hebra conductora es necesario un solo cebador, en cambio en la hebra retardada se requiere más de uno. Estos RNA ceba­dores se producen a intervalos sobre la hebra retardada, luego la sín­tesis se continúa por la acción de la DNA polimerasa, formándose así los fragmentos de Okazaki. La DNA polimerasa agrega nucleótidos hasta encontrar el extremo 5' del RNA cebador del fragmento próximo. Para producir una cadena continua de DNA deben eliminarse los RNA cebadores y sustituirlos por DNA. Los RNA cebadores son removidos por una enzima con actividad exonucleasa y reemplazados por DNA por la acción de la DNA polimerasa, además una ligasa une el extremo 3' del nuevo fragmento y el 5' del próximo (Figura 17).

Figura 11: El apareamiento de las bases proporciona el mecanismo para la replicación fiel del DNA.

Figura 12: Etapas de la síntesis de cada fragmento de Okazaki. La hebra hija que se sintetiza de manera continua se denomi­na hebra conductora y la que se sintetiza en forma discontinua recibe el nombre de hebra retardada. Se denomina hebra retardada porque si bien su síntesis global es en dirección 3' 5' cada fragmento se sintetiza en dirección 5' 3'.




Figura 13: Replicación en procariotas
Replicación en procariotas se realiza por una sola enzima ADN polimerasa III y se forma un bucle para que ambas cadenas se sinteticen en el mismo momento (Figura 13). En eucariotas hay mas de una ADN polimerasa actuando al mismo tiempo: la polimerasa alfa y la delta. Una para la hebra continua y otra para la discontinua (figura 14).

Figura 14: Replicación en eucariotas

Fidelidad en la replicación del DNA


La fidelidad del copiado en la replicación es tan alta que sólo se produce aproximadamente un error cada 109 pb. El DNA puede presen­tar formas tautoméricas raras de las cuatro bases en proporciones de 104 o 105 . Estas formas tautoméricas no se aparean bien, por ejemplo la forma tautomérica de C se aparea con A y no con G, provocando una mutación.

La fidelidad de la replicación del DNA depende de mecanismos de corrección, ejecutados por la DNA polimerasa. Durante la polimerización esta enzima requiere un extremo 3' OH libre con bases bien apareadas, si esta condición no se cumple todos los nucleótidos mal apareados se eliminarán por actividad exonucleotídica.

Por esta capacidad se dice que la DNA polimerasa es autocorrectora porque es capaz de eliminar sus propios errores.

Si existiese una polimerasa que sintetizara en dirección 3' 5' (crecimiento por la cabeza), los errores de polimerización no podrían ser eliminados por hidrólisis del enlace fosfodiéster, ya que generaría un extremo 5' inactivo (monofosfato) que provocaría el final de la síntesis.

Esto demuestra que es mucho más fácil corregir una base mal apa­reada en el extremo 3' de la cadena en crecimiento, permitiendo que el mecanismo de replicación sea más exacto (Figura 18).

Figura 17: Los RNA de los segmentos de Okazaki deben ser eliminados.



Figura 18: Proceso de autocorrección de la DNA polimerasa.

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