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Trabajo publicado en www.ilustrados.com

La mayor Comunidad de difusión del conocimiento
CAJA DE SEGURO SOCIAL

EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA FRENTE AL BIOTERRORISMO




Lic. Eric Caballero J


INDICE



  1. Introducción




  1. Definición




  1. Consideraciones respecto a las armas biológicas




  1. Objetivos de las armas biológicas




  1. El bioterrorismo en la historia




  1. Característica del arma biológica ideal




  1. Elementos que sugieren un ataque Bioterrorista




  1. Agentes etiológicos de las armas biológicas




  1. Bioseguridad en el manejo de agentes biológicos peligrosos




  1. Las peores amenazas




    1. Bacillus anthracis

    2. Yersinia pestis

    3. Botulismo

    4. Tularemia

    5. Fiebre hemorrágica viral


e1) Virus del Ebola

e2) Virus de Marburg

e3) Virus de Lassa

e4) Otros virus productores de fiebre hemorrágica


    1. Viruela




  1. Tecnología utilizada para detectar agentes de bioterrorismo




  1. Red de Laboratorios de Respuesta para monitorear ataques por bioterrorismo




  1. Bibliografía de interés



  1. INTRODUCCIÓN


Los actos terroristas del 11 de Septiembre del 2001 en los Estados Unidos fueron seguidos de acciones impensables en el servicio de correo americano que nos hicieron recordar una forma de guerra tan antigua como escalofriante : El uso de agentes biológicos como armas de guerra.
A partir de éste momento el mundo comprendió que un nuevo elemento de guerra había entrado a la escena política, el bioterrorismo, una amenaza que permaneció latente por muchos años. Hasta entonces, la vida en los laboratorios de microbiología transcurría normalmente en su lucha incesante por diagnosticar procesos infecciosos comunes. Con la llegada de éstos incidentes, los laboratorios microbiológicos de las instituciones de salud, como los de investigación y producción de productos biológicos, deben unir esfuerzos e implantar sus propias políticas, ante la eventualidad de un ataque con un agente biológico dañino, denominado popularmente como la bomba atómica de los países pobres.

Estos actos de terrorismo han generado numerosas consultas de los estados miembros de la Organización Panamericana de la Salud sobre las consecuencias si se dieran actos similares en el futuro, así como también la forma de responder a ésta amenaza a los países del hemisferio.

Ante estas preocupaciones , el Organismo convocó a una reunión consultiva de expertos de las Américas sobre bioterrorismo el 24 de Octubre del 2001 la cual recomendó a sus miembros implementar acciones con el fin de establecer las medidas para fortalecer la capacidad de los laboratorios para detectar, identificar, investigar y responder rápidamente a los informes de enfermedades infecciosas emergentes asociadas a actos terroristas y mejorar las redes de laboratorios con el fin de fortalecer el diagnóstico de agentes potencialmente utilizables para el bioterrorismo.

En éste contexto, creemos necesario la elaboración de éste Manual de procedimiento para los laboratorios de microbiología, tal que sea una guía en la evaluación de los agentes potencialmente utilizables como arma biológica, los nuevos elementos de biotecnología aplicados para la detección de éstos agentes y la implementación de los laboratorios Centinelas para monitorear estos actos.
Lic. Eric Caballero J

ecaballe@cwpanama.net


  1. DEFINICION :


Bioterrorismo es la amenaza o uso intencional de virus, bacterias, hongos o toxinas de organismos vivos para producir terror, muerte o enfermedad en seres humanos, animales o plantas .

3. CONSIDERACIONES RESPECTO A LAS ARMAS BIOLÓGICAS :

La amenaza de las armas bacteriológicas es real y creciente, alimentada por los descubrimientos científicos y los conflictos políticos en todo el mundo. Esta amenaza se amplia debido a un rasgo único de las armas biológicas : la inseguridad. Las bombas explosivas dejan pocas dudas sobre el número de víctimas que causan, pero en caso de un ataque con armas biológicas sobre una ciudad, las autoridades no sabrían la fuente ni la naturaleza del brote o el número probable de víctimas.
A diferencia de las afecciones causadas por agentes químicos que son obvias e inmediatas, las enfermedades producidas por agentes biológicos usadas con fines bioterroristas se presentan insidiosamente, los primeros casos serán vistos, dependiendo del período de incubación del agente, en horas, días o semanas post-exposición. Los servicios de urgencia o de atención ambulatoria recibirán las primeras consultas y el diagnóstico habitualmente será difícil ya que los síntomas iniciales de todas estas enfermedades son inespecíficos y los cuadros clínicos más estructurados corresponden a enfermedades que no se diagnostican en forma habitual. En ese momento es muy probable que nuevos casos empiecen a ser consultados o la transmisión persona a persona de cuenta de la expansión del brote o epidemia. Este tiempo de reconocimiento precoz de los primeros casos es vital para organizar un sistema de vigilancia que incluya la definición y la difusión del problema, la metodología diagnóstica, alternativas terapéuticas y prevención con vacunas o terapia profiláctica. En esta organización deben interactuar organismos de salud como hospitales, servicios de urgencia, unidades de epidemiología, laboratorios de diagnóstico microbiológico y toxicológico, redes de salud, centros de investigaciones médicas, sociedades de profesionales de la salud , laboratorios farmacéuticos, especialmente los que trabajan con vacunas y drogas y los organismos nacionales de defensa y protección. Finalmente, todos ellos deberán ser responsables de mantener una buena comunicación entre sus distintos niveles y transmitir a la población información real y concreta que ayude a controlar los niveles de ansiedad de quienes han sido expuestos a alguno de estos agentes biológicos.

La respuesta mundial a los crecientes peligros de las armas biológicas, no ha satisfecho la esperanza requerida. El tratado de 1972 para la no proliferación de armas químicas y

biológicas, fue un paso útil que cimentó el consenso internacional de que éste tipo de armas era moralmente horrible. Las violaciones flagrantes al pacto por las naciones que se habían comprometido a cumplirlo, subraya sus inherentes debilidades.
Durante la “guerra fría” a pesar de que predominó el concepto de lo que se ha denominado como “ceguera nuclear”, visión definida como la actitud de que el poder de destrucción nuclear es tal que nada más puede ser tomado en cuenta, Estados Unidos continuó con un programa de armas biológicas, al igual que Rusia, desarrollándose dos sitios principales de producción de agentes biológicos: Fort Detrick en Estados Unidos

Al Hakam en Irak y BioPreparat , Obolensk, Stepnogorsk, Vector, Sverdlovsk y la Isla Vozrozhhdeniye en la Unión Soviética.
La batalla de gobierno americano contra las cartas cargadas de esporas ilustró las enormes lagunas científicas respecto al Ántrax, uno de los gérmenes más antiguos y más eficaces que los científicos militares habían convertido en arma.
El 21 de Enero de 1999 el expresidente norteamericano Bill Clinton manifestó en una conferencia de prensa : “ Ni siquiera las armas nucleares o las armas químicas son tan aterradoras como la guerra bacteriológica. Aunque un ataque químico sería finito, un ataque biológico se extendería por la tierra, sobre todo si los perpetradores liberaran un agente contagioso que no fuera identificado rápidamente, ni tratado de manera adecuada. Un ataque con gérmenes, sería un regalo que va de mano en mano ”.
Las toxinas biológicas son cientos e incluso miles de veces más letales por unidad de peso que cualquier agente químico conocido. Desde la perspectiva militar, las armas

biológicas tienen diferentes tiempos para hacer su efecto, lo que las hace impredecibles, y por lo tanto ejemplares para operaciones clandestinas y/o guerra de baja intensidad.

Se estima que un arsenal biológico puede ser producido en un espacio de no más de cinco metros cuadrados y con una inversión de $ 10,000.00 en equipo. Por esto, “ la bomba atómica de los países pobres ” puede ser desarrollada por cualquier país a un costo muy bajo. Se estima que el costo por atacar con armas convencionales a civiles desprotegidos es de aproximadamente $ 2000.00 por kilómetro cuadrado, de 800 dólares con armas nucleares, 600 dólares con gases químicos, y un dólar con el uso de armas biológicas. ( Ref. Robinson p. The problems of chemical and biological Warfare.1998. CB Weapons today. ).
Muestras de la biotecnología aplicada al terrorismo, especialmente en el campo de

la ingeniería genética fueron los trabajos del equipo militar Ruso de investigaciones en los Institutos Obolensk y BioPreparat que manifestaban haber podido reestructurar la legionella modificada con genes de mielina, tal que aunque el microorganismo fuera

eliminado, aún permanecía en el paciente síntomas de parálisis y daño cerebral como reacción posterior por la infección de esta cepa de Legionella recombinante. Igualmente se trabajó en introducir en la bacteria de la peste ( Yersinia pestis ), el gen que crea la toxina de la difteria. Así también cepas de Ántrax resistente a antibióticos y a las vacunas, como también cepas mortales con marcadores étnicos.
La comunidad internacional ha empezado a debatir si los ingenieros genético y los médicos militares, deberían adoptar su propia versión del juramento Hipocrático : No hacer daño

Todo lo anterior nos permite hacer válido en nuestros tiempos las palabras del estadista americano Thomas Jefferson : El precio de la libertad, es la eterna vigilancia.

4. OBJETIVOS DE LAS ARMAS BIOLÓGICAS :
Los objetivos de las armas biológicas dependen de lo que se pretende conseguir, tanto en la población como en el ambiente; sin embargo, ellas están dirigidas principalmente a :


  • Seres humanos ( Combatientes o civiles ).

  • Cosechas alimenticias.

  • Animales.

  • Plantas de tratamiento de agua.

  • Suelo.

  • Aire.

  • Combinaciones de varios objetivos.


La utilidad de las armas biológicas están dirigidas principalmente para :


    • Eliminar a la población para ocupar territorio

    • Eliminar o invalidar fuerzas militares o estratégicas

    • Producir terror

    • Objetivos políticos



  1. EL BIOTERRORISMO EN LA HISTORIA :


El empleo de agentes biológicos como arma no es un concepto nuevo. La historia de su uso ofrece numerosos ejemplos de su utilización aun antes del desarrollo de la microbiología. Existen evidencias que sugieren que civilizaciones como las de los persas y romanos contaminaban el agua potable de pozos y acueductos de sus enemigos arrojando en ellos animales muertos.
En el siglo VI AC Asirios envenenan los pozos enemigos con desechos pútridos.
Durante el siglo XIV en el sitio de Kaffa (ahora Feodossia ) en Ucrania, las fuerzas tártaras sitiaron la ciudad y obligaron a rendirse a sus habitantes infectándolos intencionalmente con Yersinia pestis al lanzar con catapultas por sobre las murallas de la ciudad los cuerpos sin vida de sus propios soldados muertos por plaga. Esta enfermedad epidémica causó el aniquilamiento de un tercio de la población europea de la época. Esta misma estrategia bélica fue utilizada por el ejército ruso contra Suecia en 1710.
En 1532 en la conquista de Perú, Francisco Pizarro reparte ropa ( frazadas ) de muertos por viruela entre los Incas, consiguiendo la diseminación de la viruela en forma muy efectiva. Igual en EEUU, en 1763, Sir Jeffrey Amherst, comandante de tropas británicas durante la guerra de independencia de Estados Unidos, diseminó la viruela

entre los nativos americanos utilizando pañuelos y cobijas de personas que habían muerto de viruela.
Entre 1937 y 1941 en la unidad 731, se experimentó en Ping Fang Manchuria una amplia gama de agentes virales y bacterianos, especialmente Antrax, inoculándolos directamente o a través de aire, agua o alimentos contaminados tanto en animales como en humanos, causando la muerte de más de 10,000 personas. Con posterioridad a la Segunda Guerra Mundial se estimó que alrededor de 3000 prisioneros murieron en relación a estos experimentos. En 1940, se produjo una epidemia de plaga en China y Manchuria, su inicio se relacionaron con una "lluvia de pulgas" infectadas con Yersinia pestis arrojadas por aviones japoneses que sobrevolaron la zona afectada.
En 1979 una falla en los sistemas de filtración dio origen a un pequeño aerosol

de esporas de ántrax, que se diseminó en la población de Sverldovsk, originando 79 casos de ántrax de los que 66 murieron. En 1984 Durante un solo mes en   Dallas, Oregon, 751 personas desarrollaron gastroenteritis por Salmonella luego de la contaminación de los “salad bar” en varios restaurantes por el culto religioso Rajneeshees.
En el año 2001 los casos de contaminación por Anthrax en EEUU fueron actos terroristas.

6. CARACTERISTICA DEL ARMA BIOLÓGICA IDEAL :
Las armas biológicas se caracterizan por tener grandes ventajas como :


  • Cobertura de grandes áreas.

  • No producen daños al material inerte.

  • Son baratos al comparar con otras armas.

  • Difícil detección e Identificación debido a los largos períodos de

incubación.

  • No detectable por nuestros sentidos : Incolor, inodor.

  • Permiten el progreso Epidémico.



Por lo anterior, las características de un arma biológica perfecta deben ser :


  • Alta infectividad ( Dosis infectante baja ). Que requiera pocos organismos

o pequeña cantidad de material.

  • Que sea muy contagioso ( Rapida diseminación ).

  • Altamente letal.

  • De fácil diseminación y estable en almacenamiento ( Listo para usar )

  • Resistente a las condiciones ambientales.

  • Resistente a tratamiento ( Vacunas, antibióticos, drogas, antídotos, etc ).


Creemos que ésta denominación recae sin lugar a dudas en el Ántrax.


  1. ELEMENTOS QUE SUGIEREN UN ATAQUE BIOTERRORISTA :


Durante la rutina diaria de los microbiólogos, se tiene una idea razonable de los microorganismos que están involucrados en los diferentes procesos infecciosos, por lo que la investigación se enfoca en primer lugar en los agentes típicos de los enfermedades infecciosas. Sin embargo, cuando se trata de un ataque terrorista con armas biológicas, el microbiólogo debe pensar primero en lo menos probable, ya que los agentes involucrados no forman parte de la rutina investigativa en los laboratorios de microbiología. Por esto decimos que en caso de sospecha de ataque bioterrorista, “ Cuando oigas pasos sonar … piensa primero en  , no en caballo ”

Algunos elementos que pueden sugerir un ataque bioterrorista pueden ser :



  • Epidemia sorpresiva de síndromes clínicos específicos en población definida.

  • Aumento rápido de número de enfermos procedentes de población sin factores de riesgo.

  • Muertes inexplicadas.

  • Brote de enfermedad más grave que lo conocido.

  • Muchos casos de enfermedad adquirida por vía menos frecuente.

  • Casos únicos de enfermedad previamente inexistente.

  • Brotes por cepas inusuales.

  • Brotes en humanos con casos en animales.

  • Mayor número de casos con evolución fatal de los esperados.

  • Brotes anunciados por grupos terroristas.

  • Inusual brote de enfermedad fuera de temporada o área geográfica.

  • Enfermedad inexplicada en adultos jóvenes.

  • Aumento de casos de parálisis flácida aguda o erupciones en extremidades.

  • Enfermo con una enfermedad inusual y que está descrita como potencial arma biológica en personas que no estaban expuestos a éstos agentes por su trabajo, viajes, etc.



Ref. CDC- MMWR. October 19,2001/50(41);893-89
Por lo anterior, es importante tener siempre presente que :


  • A diferencia de las sustancias químicas, los efectos de los agentes biológicos serán vistos en muchos casos en días después de la exposición.

  • El reconocimiento precoz de los casos ( la mayoría tiene signos inespecíficos ),

es vital para organizar un sistema de vigilancia que evite la propagación masiva.



Defensas contra las armas biológicas


  • Máscara respiratoria : Los filtros, normalmente de carbón activado, han de bloquear las partículas mayores de un micrometro.

  • Refugio : Lo mejor es un habitación cerrada, aislada con un recubrimiento plástico o de cualquier otro material aislante y ventilación con aire filtrado.

  • Descontaminación.

  • Vacunación : Para agentes específicos. Para muchos agentes no se conoce vacuna.

  • Antibióticos : Son eficaces frente algunas bacterias, pero no frente a todas.

( Ineficaces contra los virus.)

  • Sistemas de detección : La mejor arma es la prevención.

8. AGENTES ETIOLÓGICOS DE LAS ARMAS BIOLÓGICAS :

Desde el punto de vista práctico, casi cualquier germen capaz de causar enfermedad, puede ser utilizado como arma biológica, ya que cada uno tiene características morfológicas, patológicas y epidemiológicas que pueden ser aplicadas dependiendo del daño que se quiera infligir. Sin embargo, en Centro para el Control de Enfermedades Transmisibles de Atlanta ( CDC ) ha hecho una clasificación que es utilizada mundialmente. En dicha lista se incluye tres categorías en función de la facilidad de su transmisión y mortalidad producida.


  1. CATEGORIA A :




  • Requieren alta prioridad de respuesta

  • Se diseminan fácilmente o se transmiten persona a persona

  • Producen alta mortalidad, con potencial para un gran impacto en salud pública.

  • Pueden causar pánico y desequilibrio social

  • Requieren acción especial/intervención sanitaria pública

  • Es necesario preparación previa del personal



Entre ellos están :


  • Bacillus anthracis (ántrax)

  • Toxina del Costridium botulinum (botulismo)

  • Yersinia pestis (peste)

  • Variola mayor (viruela)

  • Francisella tularensis (tularemia)

  • Fiebre hemorragica viral ( Ebola, Lassa, Marburg )


CATEGORIA B :


  • Se diseminan con facilidad moderada

  • Causan morbilidad moderada y mortalidad baja

  • Requieren refuerzos específicos de la capacidad diagnóstica y aumento en la vigilancia de la enfermedad

Incluye a


  • E. coli 0157:H7

  • Brucelosis

  • Shigella dysenteriae

  • Enterotoxina B de Estafilococcus aureus

  • Vibrio cholerae

  • Burkholderia mallei

  • Burkholderia pseudomallei

  • Toxina del Cl. perfringes


CATEGORIA C :



  • Son fácilmente disponibles.

  • Presentan facilidad en su producción y diseminación.

  • Posee potencial para provocar alta morbilidad y mortalidad, además de tener impacto público importante.



Entre ellos


  • Hanta virus

  • Fiebre amarilla

  • TBC multirresistente

  • Cryptosporidium sp

  • Virus Nipah


  1. BIOSEGURIDAD EN EL MANEJO DE AGENTES BIOLOGICOS

PELIGROSOS :
Las Normas de trabajo en microbiología obligan al establecimiento rutinario de medidas estrictas en el manejo de especimenes potencialmente peligrosos. Estas indicaciones se multiplican cuando se trata de microorganismos potencialmente utilizables como armas biológicas, debido a la letalidad reconocida de éstos agentes. Por lo anterior recomendamos firmemente las Normas del CDC de Atlanta al respecto. ( Ref. Primary Containment For Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. CDC/NIH. U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service. Washington, 1995 ). (Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. CDC/NIH. U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service (4ª ed.). Washington, 1999 ).

Cabina de Seguridad Clase III


Riesgo en el laboratorio de los agentes de bioterrorismo :

Agente BSL Riesgo
B. Anthracis 2 Bajo

Y. pestis 2 mediano

Brucella spp. 2 / 3 Alto

Agente BSL Riesgo

F. Tularensis 2 / 3 Alto

Toxina Botulinum 2 Mediano

Viruela 4 Alto

Fiebre hemorrágica viral 4 Alto

PRECAUCIONES


  • Utilizar cabina de seguridad biológica de nivel II ( BSL-2) ó III ( BSL-3).

  • Evitar cualquier actividad en el área del personal con riesgo de exposición y especialmente la producción de aerosoles.

  • Descontaminar el laboratorio después de cada uso y descarte todo el material en receptáculos apropiados. Esterilice la bata.

  • Evite tocarse las mucosas con las manos ( con o sin guantes ).


10. LAS PEORES AMENAZAS :
Las peores amenazas están como es de esperar, dentro del grupo A , y entre ellas describiremos a las principales :


  • Bacillus anthracis

  • Yersinia pestis

  • Francisella tularensis

  • Viruela

  • Toxina del Clostridium botulinum

  • Fiebre hemorragica viral ( Virus de Ebola, Lassa y Marburg ).


Todos estos microorganismos utilizan uno o varias rutas de entrada al organismo, :


  • Ingestión (Gastrointestinal ) por contaminación del agua y alimentos

  • Inyección (Piel / Membranas mucosas) por cortaduras, lesiones leves, etc

  • Inhalación (Respiratorio ). Especialmente aerosol. Contaminación del aire



a) Bacillus anthracis



B. anthracis en agar sangre

B. anthracis , un bacilo grampositivo esporulado, fué la primera bacteria que se identificó como causante de una enfermedad. Su nombre deriva del griego Anthrakis que significa carbón, en alusión al color negro de su pústula, por lo que se le conoce también como Carbunco. Ya El Génesis lo cita como causante de la V Plaga de Egipto. Es una enfermedad zoonótica caracterizada por la habilidad del bacilo para formar esporas. El Carbunco natural es primariamente una enfermedad zoonótica de herbívoros : Cabras, ovejas, vacas, caballos y otros animales transmiten el bacilo por medio de la piel, cuero, lana, pelo, huesos, heces, orina y saliva.
Es endémica en muchos países como México, Nicaragua, Argentina, Bolivia, Perú, Africa central y China. Las humanidad tuvo la suerte que dos de los más grandes microbiólogos lo estudiaran : Roberto Koch reprodujo la enfermedad en animales y Luis Pasteur creó la primera vacuna ( animales ).
Los factores de virulencia que se conocen son tres proteínas denominadas en conjunto toxina del carbunco y un polipéptido capsular antifagocitario.

Ellos son el Factor Edema (FE), el Factor Letal (FL) y el Factor Antígeno protector (AP). Los genes encargados de elaborar la toxina del carbunco y el polipéptido capsular se hallan en plásmidos de B. Anthracis independientes. La combinación de los factores en una cepa produce los signos clínicos específicos, así :

FE + AP : Produce edema. 

AP + FL : Producen la actividad letal.

FE + FL : Inactivo. 

AP + FL + FE : Produce edema y necrosis y es letal.
La toxina del Factor Letal (LF) del Anthrax afecta las células dendríticas y disminuye la respuesta inmune para combatir el microorganismo ( Ref. Nature. Emory University. July 17, 2003 ).
Algunas características clínicas son :


  • Dosis infectiva (LD50): 8,000 - 15,000 esporas

  • Periodo de Incubación : 1-6 días

  • Duración de la enfermedad : 3-5 días

  • Fiebre, malestar y fatiga

  • Abrupto distrés respiratorio…muerte < 24 hrs

  • No hay transmisión de persona a persona

  • Los aislamientos son sensibles a las drogas de elección : Doxyciclina y Ciprofloxacina.



El ántrax es considerada el arma biológica perfecta por sus características :


  • Letal ( forma respiratoria )

  • Requiere dosis baja

  • Bajos costos de producción

  • Fácil almacenamiento

  • No detectable por los sentidos ( Inolor, Indolor )

  • Resiste malas condiciones ambientales ( espora )

  • Fácil de diseminar

  • Resistente a desinfectantes


La Oficina de Evaluación de Tecnología del Congreso Americano informó que un pequeño aeroplano cargando 100 kg de esporas de ántrax podría utilizar un fumigador para diseminar una dosis fatal para 3.000.000 de personas. Un informe de la Organización Mundial de la Salud estimó que si un aeroplano libera 50 kg de ántrax a lo largo de 2 km en la dirección del viento, sobre una población de 500.000 personas, 95.000 podrían morir y 125.000 serían incapacitadas.

Tiene tres formas de infección : Inhalación, cutánea e intestinal.




Ciclo del Anthrax
a1 ) Ántrax cutáneo :
Ocurre al entrar en contacto la bacteria ( Espora ) con piel no intacta. Tiene un periodo de incubación de 1 a 10 días. Produce una pápula indolora, luego evoluciona a úlcera necrótica típica. Esta es la forma más común en casos naturales. Generalmente ocurre en la cabeza, antebrazos y manos, causando inicialmente un prurito, luego evoluciona a una pápula y luego a una escara negra hundida, rodeada de edema.


a2) Ántrax intestinal :

La forma intestinal de Antrax puede seguir al consumo de alimentos, especialmente carne de animales contaminados, caracterizado por una inflamación intestinal aguda. Perido de incubación de 1 a 10 días.
Los signos iniciales son náusea, pérdida de apetito, vómito y fiebre , seguido de dolor abdominal, vómito y severa diarrea sanguinolenta.

Tiene una mortalidad entre el 50% - 100%, especialmente en niños.

c3 ) Ántrax por inhalación :
Las esporas de ántrax aerosolizado causan la forma respiratoria de la enfermedad (conocida tradicionalmente como la enfermedad de los cargadores de lana). Las Esporas son inhaladas y luego ingeridas por los macrófagos . Pasan a alveolos y bronquiolos donde germinan y producen toxinas que causan edema , hemorragia y efusión pleural.

Luego de un período de incubación de 1 a 5 días, el paciente desarrolla una enfermedad prodrómica caracterizada por fiebre, malestar, tos no productiva y malestar respiratorio. Un período asintomático de 2 a 3 días puede ocurrir, o el paciente puede progresar directamente a una enfermedad fulminante con disnea severa, estridor, cianosis, distrés respiratorio, mediastinitis hemorrágica, shock séptico, meningitis (50%) y muerte. Una vez que los síntomas ocurren, el ántrax inhalatorio es usualmente fatal a pesar del tratamiento antibiótico ( Ciprofloxacina ).
Las cartas contaminadas con ánthrax enviadas a los senadores Brokaw y Daschle y a algunos medios periodísticos posterior al ataque a las Torres Gemelas de New York, provocaron el caos mas grande en los sistemas de correo del mundo. La aparición del primer caso de ántrax pulmonar en Florida confirmó estas aprehensiones. Entre octubre y noviembre del 2001 ocurrieron 10 casos de ántrax pulmonar producto de inhalación de esporas enviadas por correo en cartas o paquetes. Mas de 125,000 muestras clínicas evaluadas. Un millón de muestras ambientales estudiadas. Incluso fue necesario la preparación de Manuales para la vigilancia de las cartas en el correo. ( Ref. CDC - Recommendation for Protecting Workers from Exposure to Bacillus anthracis in Work Sites where Mail is Handled or Processed. Oct 31, 2001 ). Todo lo anterior obliga a los laboratorios a establecer protocolos de trabajo para manejar casos similares en el futuro.

DIAGNOSTICO ETIOLOGICO DEL ANTHRAX :

a) Especimenes aceptables :


1. Anthrax cutáneo :
a. Etapa vesicular: Coleccione el líquido vesicular de manera aséptica con un hisopo estéril, de una vesícula no abierta.

Nota: Los bacilos del ántrax son vistos con más probabilidad por tinción de Gram en la etapa vesicular.

b. Etapa de Escara : Recoger el material de la escara cuidadosamente

levantando el borde externo de la escara; insertar un hisopo estéril, después

rotar lentamente debajo del borde sin desprenderla.

2. Ántrax gastrointestinal :
a. Cultivo de sangre: Recoger el volumen de la sangre y el número apropiados

de botellas según el protocolo del laboratorio. En fases posteriores

enfermedad (2-8 días post-exposición) los cultivos pueden producir

crecimiento del microorganismo, especialmente si se obtienen antes del

tratamiento con antibióticos.

b. Heces: Transfiera ≥ 5 g de las heces directamente en un envase hermético,

limpio, seco, estéril y de boca ancha.

c. Hisopo Rectal : Para pacientes a los que no se les puede recoger espécimen,

obtenga una muestra insertando un hisopo rectal dentro del esfínter anal.
3. Ántrax por Inhalación :
a. Cultivo de sangre: Recoger el volumen de sangre y el número apropiados de

set según el protocolo del laboratorio.

b. Esputo: Recoger > 1 ml de espécimen del tracto respiratorio inferior en un

envase estéril. El ántrax de Inhalación por lo general no da lugar a la formación de esputo.

b) Transporte del espécimen y almacenamiento :


1. Hisopos : Transportar directamente al laboratorio a temperature ambiente. Para

transporte por > de 1 hora, transportar a 2 - 8°C.

2. Heces : Transportar las heces no preservadas al laboratorio dentro de 1 hora.

Para transporter por > 1 hora, trasnporte a 2-8°C en medio de Cary-Blair o

equivalente.

3. Esputo : Transportar en envase estéril, con tapa de rosca, a temperature ambiente.

Cuando el tiempo de transporte es de > 1 hora, transporte a 2 - 8°C.

4. Hemocultivos : Transporte directamente al laboratorio a temperature ambiente.

c) Cultivo :
c1) En la cabina de bioseguridad clase II o III, inocule la muestra en medios de agar

sangre al 5%, agar alcohol-fenil-etílico y Tioglicolato o su equivalente.

c2) Incubar por 24 horas a 35 – 37 ◦ C a temperatura ambiente ( CO2 es aceptable ).
d) Lectura :

Observe el crecimiento y haga las pruebas bioquímicas necesarias para la identificación y diferenciación del germen.

d1 ) Criterios de identificación presuntiva :


  • Bacilos Grampositivos

  • Crecimiento característico en agar sangre ( Colonias rugosas, de 2 a 5 mm de diámetro, convexa, de bordes irregulares )

  • Formador de esporas

  • Movilidad negativa

  • Catalasa positiva

  • Formación de cápsula (La tinta china permite visualizar la cápsula en muestras de sangre y LCR ).

  • No hemolítica en agar sangre



Criterio de descarte : La morfología al Gram, la hemólisis o la movilidad, pueden descartar la presencia del B. anthracis.





Frotis por Gram de B. anthracis


Tips :


  • La especie más común de Bacillus sp. enviado al CDC para descartar B. anthracis es la variedad no motil de B. megaterium.

  • Diferenciar las colonias del B. cereus var. mycoides.

  • Inactivación en el laboratorio : 121º C por 45 minutos.


Ref. J. of Clin. Microb. Vol.41, No.2, February 2003
DIFERENCIACIÓN ENTRE BACILLUS ANTHRACIS Y BACILLUS sp


Ref : Bioterrorism: Implications for the clinical microbiologist. Clin. Microb. Review, April 2001, p.364-381, Vol.14, No.2


Vacuna contra el Anthrax :


  • La primera vacuna por Luis Pasteur (1881).

  • 6 dosis (ya hay protección después de 3era).

  • Efectividad 93% para infección cutánea y muy alta para respiratoria.

  • Vacuna para animales no sirve para humanos.

  • Indicación limitada a personal de laboratorios de ántrax, militares, trabajadores con animales.

  • La vacuna consiste en un filtrado estéril no infeccioso de un cultivo de una cepa atenuada de B. anthracis, absorbida a un adyuvante( hidróxido de aluminio). BioThrax™ [BioPort Corporation, Lansing, Michigan].

  • El componente protectivo de la vacuna es un extracto de antígeno protector. Formaldehído (concentración final, 0,02% ) es adicionada como estabilizador y cloruro de benzeno (0.0025 % ), como un preservativo.

  • Es imposible contraer la enfermedad a partir de la vacuna.



Desinfección / Destrucción de esporas de B. anthracis :

Desinfectantes usados para destruir las esporas del B. anthracis

  1. Formalina al 2 a 10% por 30 minutos a 40 °C

  2. Formalina al 0.25% por 6 horas a 60°C

  3. Acido paracetico al 3% a razón de 8 litros (2 galones) /metro cuadrado por 10 minutos.

  4. Hipoclorito del sodio (10.000 PPM) 5 –10 minutos a temperatura ambiente

  5. Iodo a 100 –300 PPM por 1 –5 minutos a temperatura ambiente

Uso del calor para destruir el B. anthracis

Para pequeños volúmenes o contaminación ligera, autoclavar a 121 o C por 30 minutos. Para bolsas de autoclave, etc. que contiene los materiales usados y contaminados del laboratorio, platos de cultivo, etc, autoclavar a 121°C por 60 minutos

Fumigación:

El formaldehído es un gas y es generado hirviendo las soluciones del gas en agua

( formalina ) o calentando formaldehído fuertemente. El agua se satura hasta aproximadamente 37%, por lo que la formalina concentrado es 37% formaldehído.


( Ref. CDC- Manual of Laboratory Diagnosis of Anthrax. Annex 5- Disinfection and Sterilization Practices).

b) YERSINIA PESTIS :
A lo largo de la historia, Yersinia pestis, agente causante de la Plaga o Peste Negra, una enfermedad zoonótica que ha provocado más de 200 millones de muertes, especialmente en el medioevo ( 1300´s ), luego del contagio, una vez que llega al flujo sanguíneo del enfermo, infecta sus ganglios linfáticos, formando los 'bubones'. Después, el patógeno llega a los pulmones y la enfermedad se vuelve mortal. Constituye una enfermedad de la antigüedad, de la que existen numerosas narraciones bíblicas y medievales, y que ha permanecido hasta nuestros días.

La transmisión al hombre es mayor durante primavera y verano, época en la que se incrementa la vida al aire libre y el contacto con los animales responsables de la transmisión. Los roedores urbanos y selváticos ( ratas, ardillas y coyotes ) y las pulgas son los principales agentes transmisores de la enfermedad. El hombre se contagia cuando es picado por las pulgas de las ratas infectadas. La peste bubónica posee un período de incubación de hasta una semana, tras la cual los microorganismos proliferan en los ganglios linfáticos de la región del cuerpo donde se produjo la picadura.

Existen distintas formas clínicas, de las cuales la más común es la forma bubónica. Otras menos comunes, pero más graves son la neumónica ( respiratoria ) , septicémica y meníngea. Habitualmente comienza como un cuadro febril, acompañado de escalofríos, cansancio y dolores de cabeza. Posteriormente aparece el denominado bubón, con hinchazón y un intenso dolor en la región corporal afectada a la palpación de ganglios linfáticos (sobre todo de la ingle, axila y cuello). Estas lesiones son ovaladas, de varios centímetros de diámetro, sobreelevadas y de color rojizo.

 Lo característico del cuadro es la brusca instalación de la fiebre y el bubón que en el curso de pocos días puede llevar a la muerte. La peste septicémica se caracteriza por presentar, además de los bubones, una invasión de los microorganismos de la circulación sanguínea con gran repercusión del estado general. En la de tipo neumónica se produce una de las complicaciones más serias de la peste: la neumonía secundaria, que llega a los pulmones a través de la sangre.

Se ha demostrado la relación de algunas pulgas ( Xenopsylla cheopsis ) como parte importante en el ciclo de la enfermedad. Recientemente se han identificado 2 factores bacterianos llamados Hemin Storage Phenotype (Hms) y Yersinia Murine Toxin (Ymt), que juegan un importante papel en mantener el ciclo de la Y. pestis en el vector.

Ref. ASM News, Vol.69, No.7, July 2003
Muestras Aceptables :



    1. 1. Tracto respiratorio bajo (neumónica): Lavado bronquial o aspirado transtraquial

    2. (≥ 1 ml). Las muestras de esputo se pueden examinar pero esto no se aconseja

    3. dado a su contaminación con flora normal de la garganta.

    4. 2. Sangre (septicémica): Extraiga una cantidad apropiada de sangre en volumen y

    5. número de juegos de acuerdo al protocolo establecido del laboratorio. Nota: en

    6. los casos en que se sospecha de plaga, una muestra adicional de sangre o cultivo

    7. de caldo (por lo general caldo nutriente) se debe de incubar a temperatura

    8. ambiente (22-28 °C), la temperatura a la cual Y. pestis crece más rápidamente.

    9. No agite el cultivo adicional en caldo ya que las características de la formación

    10. de crecimientos de Y. pestis se puedan visualizar claramente.

  1. Aspire una muestra de tejido (bubónico o biopsia: hígado, bazo, médula ósea o pulmón). Nota: los aspirados pueden producir poco material; por lo tanto un pequeño chorro con solución salina estéril se puede utilizar para obtener una cantidad adecuada de muestra. La jeringa y la aguja de la muestra aspirada deben permanecer tapadas, aseguradas con cinta adhesiva y enviadas al

laboratorio.





Transporte de la muestra


    1. 1. Respiratoria o esputo: transporte las muestras en contenedores estériles con tapa

    2. de rosca a temperatura ambiente. Si se sabe que el material será transportado de

    3. entre 2-24 horas después de la toma de la muestra, entonces mantenga el

    4. contenedor de transporte entre 2-8°C.

    5. 2. Sangre: Transporte las muestras directamente al laboratorio a temperatura

    6. ambiente. Manténgala a temperatura ambiente hasta que se coloque en una

    7. incubadora o instrumento para cultivos de sangre. No se refrigere. Siga los

    8. protocolos establecidos del laboratorio para el procesamiento de cultivos de

    9. sangre.

    10. 3. Muestras de tejido aspirado y biopsias: Remita la muestra de tejido o aspirados en

    11. un contenedor. Para muestras pequeñas añada de 1-2 gotas de solución salina

    12. normal para mantener el tejido hidratado. Transporte la muestra a temperatura

    13. ambiente para su procesamiento inmediato. Mantenga la muestra fresca (a baja

    14. temperatura) si se espera que su procesamiento se retarde.

    15. 4. Hisopos: No se recomiendan las muestras de tejidos tomadas con hisopo. Sin

    16. embargo si se toma una muestra con hisopo, este deberá reinsertarse en el paquete

    17. de transporte para ser transportado.


Frotis :
La presencia de células bipolares en estos frotis deben de disparar la sospecha de plaga. La tinción Wright frecuentemente revela las características bipolares de tinción de Y.pestis, mientras que la tinción de Gram puede no revelarlas. La tinción Wright-Giemsa son las más confiables para resaltar las características bipolares de tinción de estos bacilos gram negativos.


Tinción Giemsa de frotis sanguíneo con Y. pestis, de un paciente con septicemia

Observe el teñido bipolar de las células


Cultivo :
Sembrar en agar sangre de carnero, EMB, McConkey y medio en caldo enriquecido, tal como caldo cerebro corazón ( BHI ).



    1. Incubación de cultivos:

    2. a. Temperatura:28°C (óptima) ó 35-37°C (para crecimiento más lento)

    3. b. Atmósfera: Atmósfera ambiental, o enriquecida con CO2 al 5% es aceptable

    4. c. Duración de la incubación: Retenga las placas primarias por cinco días. Las placas se

    5. deben de retener hasta o por 7 días si el paciente a recibido tratamiento con antibióticos

    6. bacteriostáticos.



    1. Características:



    2. a. Platos de agar sangre : Y.pestis crece como colonias gris-blancas, translúcidas, usualmente de manera pequeñas para ser vistas como colonias individuales a 24 horas de incubación. Después de la incubación por 48 horas, las colonias son de color gris-blanco a amarillo y opacas. Después de 48-72 horas de incubación tienen una apariencia elevada irregular de “huevo frito”, que se vuelve más prominente a medida que el cultivo envejece. La hemólisis no se presenta o es muy poca en los glóbulos rojos de cordero. Y. pestis crecerá en colonias pequeñas no fermentadoras de lactosa en MAC o agar EMB.

    3. b. Tubos de caldo nutritivo : Y. pestis crece típicamente en cúmulos que se describen como “floculantes” o “estalactita” en apariencia cuando el caldo de cultivo no es agitado o mezclado. Esta característica NO es exclusiva de Y. pestis.



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