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fecha de publicación08.02.2016
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Actividad antibiótica de una nueva cepa de Streptomyces sp. evaluada en contra de Staphylococcus aerus y Escherichia coli

Avila Suárez Ana Belem

Metodología Científica III

Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Av. de los Barrios No. 1 Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Estado de México. CP 54090

Resumen.

El suelo, cubre la mayor parte de la superficie terrestre y constituye uno de los recursos más indispensables para los seres humanos; permite el desarrollo de diferentes tipos de vida alrededor de la corteza Terrestre y alberga una cantidad extraordinaria de microorganismos que se han adaptado a través del tiempo a partir del establecimiento de relaciones simbióticas con organismos autótrofos, como las plantas. Existen microorganismos habitantes de los suelos, cuya importancia radica en la producción de sustancias que son aprovechadas por manos humanas con el fin de satisfacer las necesidades básicas para el sustento de la vida; tal es el caso de las bacterias del género Streptomyces, reconocidas por su amplia producción de sustancias antibióticas, excretadas por la expresión de diversos genes clusters.

En el presente trabajo se evaluó la actividad antibiótica de una nueva especie del género Streptomyces, aislada de la zona de raíces de Prosoppis laevigata, en Zapotitlán las Salinas, Tehuacán, Puebla, México, contra la bacteria Gram-positiva Staphylococcus aerus y la Gram-negativa Escherichia coli empleando la técnica de gradientes en placas de agar y se elucidó la naturaleza termoestable del antibiótico producido por Streptomyces sp. sometiéndolo a una temperatura de 70°C por 15 minutos y resembrando el organismo antagonista sobre ello, se realizó lo mismo, sobre una muestra mantenida a temperatura ambiente.

Se determinó la actividad antibiótica de Streptomyces sp. en contra de Staphylococcus aerus durante 6 días de incubación, y se estableció una relación directamente proporcional entre al tiempo de incubación y la actividad antibiótica. Se encontró actividad bacteriostática de Streptomyces sp. en contra de Escherichia coli, la cual sólo se apreció después del primer día de incubación. Se compararon las actividades inhibitorias de la nueva especie del género Streptomyces sp. en contra de los dos microorganismos antagonistas, al primer día de incubación, encontrando que no había diferencias significativas en ambas pruebas. Se determinó la naturaleza termoestable del compuesto antibiótico producido por Streptomyces sp. por lo que se cree que no corresponde a una molécula proteica.

La actividad antibiótica hallada en contra de las bacterias Gram-positivas se encuentra estrechamente relacionada con el pH del suelo en el que se colectaron las muestras de la nueva especie de Streptomyces sp. que, en este caso fue neutro y alcalino, la fase de crecimiento de las colonias y el índice reproductivo. Debido a la diferencia en la actividad encontrada en ambas pruebas, es probable que el mecanismo de acción del antibiótico excretado por la bacteria de prueba, tenga lugar sobre la pared celular externa de las Gram-positivas.

Abstract.

The soil covers most of the land surface and is one of the most essential for human beings, allows the development of different types of life around the earth's crust and contains an extraordinary amount of microorganisms that have adapted through time since the establishment of symbiotic relationships with autotrophic organisms like plants. There are inhabitants of soil microorganisms, whose importance lies in the production of substances that are exploited by human hands in order to meet basic needs for sustaining life, such is the case of bacteria of the genus Streptomyces, known for their wide production of antibiotic substances, excreted by the expression of various gene clusters.

In the present study evaluated the antibiotic activity of a new species of Streptomyces, isolated from the root zone of Prosopis laevigata, in the Salinas Zapotitlan, Tehuacan, Puebla, Mexico, against Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus and Gram - Escherichia coli negative gradients using the technique on agar plates and identified thermostable or thermolabile nature of the antibiotic produced by Streptomyces sp. subjected to a temperature of 70 ° C for 15 minutes and to seed the antagonist bacteria on it, the same was done on a sample kept at room temperature.

We found antibiotic activity of Streptomyces sp. against Staphylococcus aerus for 6 days of incubation, and established a correlation between the time of incubation and antibiotic activity. Bacteriostatic activity was found in Streptomyces sp. against Escherichia coli, which can only be assessed after the first day of incubation. We compared the inhibitory activities of the new species of Streptomyces sp. against the two antagonistic microorganisms, the first day of incubation, and found no significant difference in both tests, so it is not believed to correspond to a protein molecule.

It was found antibiotic activity against Gram-positive bacteria is closely related to soil pH in which samples were collected new species of Streptomyces sp. that in this case was neutral and alkaline, the phase of colony growth and reproductive rates. Due to the difference in activity found in both tests, it is likely that the mechanism of action of the antibiotic excreted by the Streptomyces sp. takes place in the outer cell wall of Gram-positive.

Introducción.

El suelo, es la combinación de materia orgánica y mineral, agua y aire; cubre la mayor parte de la superficie terrestre y constituye uno de los recursos más indispensables para los seres humanos; se forma como resultado de una combinación de procesos físicos, químicos y biológicos, entre los factores que intervienen en su nacimiento están, la roca madre, el tiempo, el clima, las plantas, los animales, una infinidad de microorganismos y la topografía (Tarbuck y Lutgens, 2008).

El papel fundamental que desempeñan los microorganismos durante la formación del suelo, es el de lograr la disolución de las rocas mediante la producción de compuestos, como ácidos orgánicos, que sintetizan a partir de la materia orgánica generada por las plantas durante su ciclo de vida. Es en la rizosfera en donde el desarrollo microbiano suele ser más extenso; los minerales se solubilizan cada vez más y el agua, al filtrarse arrastra algunas de las sustancias liberadas por la meteorización, hacia capas más profundas; así pues se aparece un típico perfil de suelo (Madigan, et al., 2004).

Un grupo de microorganismos de gran trascendencia presente en la rizosfera de los suelos es el que corresponde a los Actinomicetos, que son bacterias Gram-positivas caracterizadas por su crecimiento en forma de filamentos ramificados con extremos formados por hifas, llamados micelios y, el mecanismo que emplean para su reproducción es formando esporas que expulsan a partir del micelio aéreo (Madigan, et al., 2004). Ambas características han sido de gran importancia evolutiva y son la base para su clasificación taxonómica (Chater, 2006).

De acuerdo con lo anterior, dentro del grupo de los Actinomicetos, se encuentran especies patógenas para los seres humanos, otras son fijadoras de nitrógeno y otras son productoras de antibióticos. De estas últimas, el género más reconocido, es el de Streptomyces, de cuyas especies se han aislado numerosos antibióticos empleados ante distintas patologías, algunos de ellos son, la estreptomicina, que fue el primer antibiótico de uso médico originado por Streptomyces en contra de la tuberculosis (a mediados de 1940), otros antibióticos aislados a partir de este género son: la espectinomicina, la neomicina, las tetraciclinas, clorotetraciclinas, eritromicina, clindamicina, nistatina, anfotericina B, y el cloranfenicol (Madigan, et al., 2004).

Algunos de los organismos de este género, como Streptomyces glaucescens, sintetizan sustancias denominadas antraciclinas, que son complejos antitumorales que se originan durante la ruta biosintética de los poliquétidos (Motamedi, et al., 1986), y además en estudios recientes se ha demostrado que parte del principio lítico llevado a cabo por especies de Streptomyces en contra de Gram-positivas se debe a la actividad de diversas enzimas acompañadas por material de naturaleza lipídica (Majer y Chater, 1987). Lo anterior significa que los principios activos producidos por Streptomyces pueden ser péptidos, lípidos y algunos metabolitos secundarios. La razón de ello se remonta en el pasado lejano de la Tierra, hace aproximadamente 550 millones de años, cuando las plantas verdes colonizaron la superficie del planeta y ejercieron de alguna forma una selección de los organismos que lograron aprovechar los nutrientes producidos por estas. De todos ellos, unos de los mejor adaptados fueron los del género Streptomyces, que crecieron como micelios ramificados, colonizando el interior de los tejidos de las plantas, ayudados por la secreción de enzimas celulasas y xilanasas; además compitieron con otros organismos muy bien adaptados, los hongos unicelulares, en contra de los cuales, liberaron enzimas quitinasas que producían la destrucción de la pared celular de los mismos. Se cree que hace 450 millones de años, ya existían todas las especies de Streptomyces que hoy en día se conocen (Chater, 2006).

Así pues, al transcurrir el tiempo, las bacterias del género Streptomyces comenzaron a producir otro tipo de moléculas antibióticas, como defensa ante los organismos que competían por los nutrientes que ellos mismos solubilizaban de las plantas y, como protección durante la formación de esporas para su reproducción. De esta manera, la producción de moléculas extracelulares está estrechamente relacionada con el crecimiento de la colonia y su multiplicación.

Hoy en día, con base en investigaciones genéticas realizadas sobre la especie Streptomyces coleicolor, se ha encontrado que una sola secuencia en el DNA es capaz de regular las tres actividades (Chater, 2006). El gen implicado en estas funciones en la especie estudiada es nombrado bld, el cuál codifica para un RNAt que es específico para el aminoácido leucina, el cual es importante en la constitución de péptidos que funcionan como señales químicas para que se lleven a cabo las actividades que preservan a la especie (Merrick, 1976).

También, se ha encontrado que la mayoría de las secuencias genómicas que controlan la producción de antibióticos en Streptomyces, son genes clusters, que en el caso de S. coleicolor se denominan actII-4 y redZ, una copia extra de cualquiera de ellos, propiciaría un incremento desproporcionado en la producción de antibióticos (Narva y Feitelson, 1990). Así pues, se han hallado numerosas especies productoras de antibióticos, como S. albus G (Majer y Chater, 1986) y, antifúngicos, como S. aureofaciens CMUAc 130 (Taechowisan, et al., 2005).

El tipo de bacterias contra las cuales actúa el antibiótico producido por Streptomyces, está estrechamente relacionado con el tipo de suelo en el que habiten, de esta forma, estudios recientes demostraron que Streptomyces provenientes de suelos ácidos, mostraban actividad inhibitoria en contra de Gram- negativas, mientras que las pertenecientes a suelos neutros contaban con actividad en contra de Gram-positivas (Nkanga y Hagedorn, 1978). Este trabajo se centra en la investigación de las propiedades antibióticas de una nueva especie del género Streptomyces, recolectada en la zona de raíces del mezquite (Prosopis laevigata) en suelos de Zapotitlán las Salinas, Tehuacán, Puebla, México, en contra de la bacteria Gram-positiva Staphylococcus aerus y la Gram-negativa Escherichia coli.

Métodos.

El aislamiento de la cepa se realizó en el laboratorio de Microbiología en la Unidad de Biotecnología y Prototipos de la FESI, empleando medio de cultivo Rennie, libre de nitrógeno. Se realizó la prueba de sensibilidad en contra de Staphylococcus aerus y Escherichia coli, de acuerdo con la técnica de gradientes en placas de agar (Nkanga y Hagedorn, 1978) en medio de cultivo Mueller Hinton; se obtuvieron resultados a diferentes tiempos de incubación, con base en 3 repeticiones realizadas para cada prueba.

Los resultados de la distancia de inhibición en las dos pruebas se trataron con un estadístico de t, y de cada una de ellas a diferentes tiempos de incubación, mediante el cálculo de la media aritmética y la desviación estándar.

Para determinar si el antibiótico producidos por Streptomyces sp. eran de naturaleza termoestable o termolábil, se cortó un segmento del agar en el que se presumía difusión de antibióticos en la prueba anterior, y se sometió a baño maría hasta alcanzar los 70°C por 15 minutos, sobre este sustrato se resembró la bacteria antagónica y se observó su desarrollo durante 3 días; se realizó una prueba control a temperatura ambiente (19°C).

Resultados.

La cepa de Streptomyces sp. inhibe el crecimiento de S. aerus, incrementando su actividad de forma directamente proporcional con el tiempo de incubación (Figura 1). En el Cuadro 1, se muestran las medias de la distancia de inhibición de Streptomyces sp. en contra de S. aerus durante los diferentes tiempos de incubación con sus respectivas desviaciones estándar; la relación tiempo-actividad se observa de manera más evidente en la Figura 2.


Cuadro 1. Promedio de la distancia de inhibición de Streptomyces sp. contra S. aerus, a diferentes tiempos de incubación. En el primer día de incubación, la distancia de inhibición es menor con respecto a los demás días, mientras que en el último día la distancia de inhibición es mayor

Figura 1. Efecto inhibitorio de Streptomyces sp. en contra de S. aerus después de diferentes tiempos de incubación. A) Después de un día. 1: Streptomyces sp., 2: área de inhibición, 3: S. aerus. B) Después de 6 días. 1’: Streptomyces sp., 2: área de inhibición, 3: S. aerus.


Tiempo de incubación (días)

Promedio de la distancia de inhibición (cm)

1

1.27± 0.12

3

1.27 ± 0.15

4

2.37 ± 0.12

6

4 ± 0.14


Figura 2. Comparación de las medias de la distancia de inhibición de Streptomyces sp. contra S. aerus, a diferentes tiempos de incubación. Aquí se hace evidente la relación tiempo-actividad.




Con respecto a la prueba de sensibilidad de Streptomyces sp. contra E. coli, no se observó un área de inhibición como tal, sino que se apreció una zona de crecimiento menos extenso de la bacteria antagonista en un espacio poco distinguible (Figura 3) después del primer día de incubación, a partir de este tiempo, no se logró apreciar ningún tipo de inhibición (Cuadro 2). En contraste con los resultados obtenidos el primer día de incubación de Streptomyces sp. en contra de S. aerus, la distancia de inhibición de este segundo ensayo, no muestra diferencias significativas, de acuerdo con la prueba de t, que resultó en un valor de 1.81, con valores críticos de ± 2.776; sin embargo, no es posible comparar ambos ensayos en los demás tiempos de incubación, debido a que Streptomyces sp. no presenta actividad en contra E. coli, después del primer día.




Cuadro 2. Distancia de inhibición de Streptomyces sp. en contra de E. coli después del primer día de incubación.



Tiempo de incubación (días)

Promedio de la distancia de inhibición (cm)

1

0.5 ± 0.46


Figura 3. Efecto inhibitorio de Streptomyces sp. en contra de E. coli después de un día de incubación. No se aprecia un área bien definida, sólo una disminución en la concentración de las colonias antagonistas. 1: Streptomyces sp., 2: Área de disminución de la concentración de E. coli, 3: E. coli.



Se determinó que el antibiótico producido por Streptomyces sp. contra S. aerus es de naturaleza termoestable, pues no se observó crecimiento de la bacteria antagonista cuando el compuesto antibiótico fue sometido a 70°C ni cuando se mantuvo a temperatura ambiente (Figura 4).


Figura 4. Naturaleza termoestable del antibiótico producido por Streptomyces sp. en contra de S. aerus; no se aprecia crecimiento de esta última A) cuando el antibiótico fue sometido a la temperatura de 70°C y, B) cuando se mantuvo a temperatura ambiente.


Discusión.

Streptomyces sp., fue colectada en suelos con pH neutro (6.9) en época húmeda y, alcalino (8.2) en época seca; por tanto era de esperarse que contara con actividad inhibitoria contra bacterias Gram-positivas, como S. aerus (Nkanga, 1978); además, se conoce que en el microambiente estudiado habitan en su mayoría bacterias con esta característica.

Por lo anterior, es posible que el mecanismo de acción del antibiótico producido por la nueva especie del género Streptomyces, tenga lugar sobre la pared celular de S. aerus; además se puede eliminar la posibilidad de que la sustancia extracelular que funciona como antibiótico, sea algún tipo de enzima lítica, pues si fuera de naturaleza proteínica se desnaturalizaría por acción del calor y se inactivaría cuando la elevación de la temperatura sobrepasa un cierto punto (Lehninger, 1979), por tanto es de esperarse que la actividad inhibitoria se lleve a cabo por acción de moléculas del tipo de los metabolitos secundarios.

Los metabolitos secundarios son moléculas que se sintetizan de manera independiente a los metabolitos primarios (proteínas, carbohidratos, lípidos y ácidos nucléicos). Mientras que estos últimos alientan la variedad de ciertas relaciones entre los organismos vivos, los primeros previenen, modifican y regulan estas relaciones, por lo general son moléculas pequeñas, cuentan con gran heterogeneidad en su estructura química, la ruta para su biosíntesis está estrictamente regulada por material genético especial, representan mecanismos de especialización celular y carecen de continuidad filogenética (Anaya, 2003).

Con respecto a la actividad de Streptomyces sp. en contra de E. coli, es probable que el antibiótico cuente con características bacteriostáticas, es decir, que detiene el metabolismo bacteriano aunque los microorganismos permanecen viables; entonces cuando, se diluye o neutraliza el agente inhibidor, las bacterias vuelven a desarrollarse (Hernández, 2002).

Ahora bien, la producción de antibióticos por bacterias del género Streptomyces, está determinada por su crecimiento y reproducción, pues la presencia de tales agentes les permite el desarrollo de la colonia. Las tres actividades ocurren simultáneamente y están reguladas por genes, que pueden ser clusters (Chater K., 2006), por tanto, es probable que la producción de antibióticos por Streptomyces sp. sea más abundante durante la fase de crecimiento exponencial de la misma.

Conclusión.

  • La nueva cepa de Streptomyces sp. produce un agente antibiótico en contra de la bacteria Gram-positiva Staphylococcus aerus, que inhibe su crecimiento.

  • A mayor tiempo de incubación, mayor es la inhibición de Streptomyces sp. contra S. aerus.

  • El agente antibiótico producido por la nueva cepa de Streptomyces sp. no es bactericida con respecto a la bacteria Gram-negativa E. coli .

  • El agente antibiótico producido por Streptomyces sp. contra S. aerus es termoestable.


Literatura citada:

  • Anaya a., 2003. Ecología química. Plaza y Valdez. México, Págs. 38-42

  • Chater K., 2006. Streptomyces inside-out: a new perspective on the bacteria that provide us with antibiotics. Philosophical transactions of the royal society. 361: 761-768

  • Hernández F., 2002. Fundamentos de epidemiología: el arte detectivesco de la investigación epidemiológica. EUNED. México, Págs. 383-384

  • Lehninger A., 1979. Bioquímica. Ediciones Omega S. A. España, Págs. 202-203

  • Madigan M., Martinko J. y Parker J., 2004. Brock. Biología de los microorganismos. Pearson Prentice Hall. España, Págs. 630-632 y 414-418

  • Majer J. y Chater K., 1986. Streptomyces albus G produces an antibiotic complex identical to paulomycins A and B. Journal of General Microbiology. 133: 2503-2507

  • Merrick M., 1976. A morphological and genetic mapping study of bald colony mutants of Streptomyces coleicolor. Journal of genetics and microbiology. 96: 299-315

  • Motamedi H., Pienkowsky E. y Hutchinson R., 1986. Isolation of Tetracenomycin C-Nonproducing Streptomyces glaucescens Mutants. Journal of bacteriology. 167 (2): 575-580

  • Narva K., y Feitelson J., 1990. Nucleotide sequence and transcriptional analysis of the redD locus of Streptomyces coleicolor. Journal of bacteriology. 172: 326-333

  • Nkanga E. y Hagedorn C., 1978. Detection of Antibiotic-Producing Streptomyces inhabiting forest soils. Antimicrobial agents and Chemotherapy. 14 (1): 51-59

  • Taechowisan T., Chunhua L., Shen Y. y Lumyong S., 2005. Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc 130 and their antifungical activity. Microbiology. 151: 1691-1695

  • Tarbuck E. y Lutgens F., 2008. Ciencias de la Tierra. Pearson Prentice Hall. España, Págs. 186-189

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