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fecha de publicación09.02.2016
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

Nombre: Carla Aulestia

Reconstitución de las cepas de referencia

Las Cepas de referencia adquiridas por el laboratorio de microbiología son registradas en planilla como marca el procedimiento.

Las Cepas de referencia son almacenadas entre 0-5 º C hasta su uso.

En la reconstitución y siembra de la Cepas de referencia, se utiliza el medio de cultivo, las condiciones de incubación y el procedimiento indicado en las disposiciones para cada tipo de microorganismo del organismo proveedor de las cepas.

Las Cepas de referencia serán sometidas a un control de calidad de pureza y viabilidad, así se le dará registro.

Control de calidad de pureza y viabilidad:

Este control se realiza a diferentes niveles del proceso; asimismo, se desempeña cada vez que se realiza un replique. El objetivo de dicho control es el de asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioquímicos.

  1. PUREZA

  • Se reactiva la cepa del congelador en un medio de baja selectividad, se incuba a 37ºC durante 24 horas.

  • Se realiza siembras por técnica de vertido con diferentes diluciones en medios de baja selectividad (TSA, PCA) y AS.

  • Se elige aquellos grados de dilución con los cuales sea posible aislar colonias independientes.

  • La toma y siembra de la colonia aislada desde la placa original se lleva a cabo con ayuda de un asa.

  • Se utiliza la técnica de estriado en medios no selectivos (agar nutritivo, TSA, PCA).

  • Con colonias bien aisladas se realiza una tinción gram para comprobar su purificación.




  1. VIABILIDAD

  • Cuando esta la cepa pura se procede a congelar en crioviales, previo a esto se cuantifica los microorganismos.

  • Se realiza un inóculo de la cepa en BHI durante 24 horas, se siembra por vertido con diferentes diluciones (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6), se incuba las cajas 24 horas a 37ºC.

  • Se realiza un contaje de las cajas que tengan colonias en un rango de 30 – 300, y se multiplica por el factor de dilución, este es el valor de referencia.

  • Realizar el mismo procedimiento de las cepas cada mes para comprobar la viabilidad.



Viabilidad = número de colonias al tiempo de muestreo x 100

Número de colonias al inicio de la conservación
Frecuencia de realización de este control:

Es el laboratorio el que establece en cada caso la frecuencia de realización del control de calidad de pureza y viabilidad para las cepas de reserva almacenadas.

En caso de no ostentar las características establecidas se ejecuta la "acciones correctivas" que se establecen en el procedimiento.

Registro de Control de calidad de pureza y viabilidad de las cepas:

  • Fecha del control.

  • Identificación de la cepa. Género y especie del microorganismo. TIPO y Nº de colección.

  • Tipo de cepa (Cepa de referencia, reserva o trabajo).

Pruebas a realizar (depende del microorganismo):

1. Coloración de Gram

2. Características de las colonias en medios selectivos

3. Pruebas bioquímicas y serológicas.
IDENTIFICACION


  • Obtener un cultivo puro

  • Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

  • Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.

  • Realización de pruebas primarias que son: 

  • Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)



PRUEBAS:
Entre las principales pruebas bioquímicas que se aconseja realizar están: catalasa, oxidasa, indol, tinción Gram, etc.
Para la caracterización existen varios métodos entre ellos la biotipificación, que consiste en la determinación de las actividades metabólicas o bioquímicas de los microorganismos frente a una variedad de sustratos, fermentación de azúcares, producción de enzimas, carácter homo o heterofermentativo.
El estudio de las características fisiológicas, crecimiento a diferentes temperaturas, pHs, concentraciones a diferentes compuestos, etc. La serotipificación estudia las propiedades antígenas de las cepas, siendo otro método eficaz para la caracterización de cepas.

También existe la determinación de género y especie, métodos fisicoquímicos que tienen como objetivo el estudio de determinados componentes químico celulares, como los lípidos, azúcares o proteínas.
Entre los métodos moleculares tenemos el análisis de la secuencia de bases de los ácidos nucleicos, es un marcador genético que puede ser utilizado como diferenciador de especies y cepas, así como organizaciones que brindan cepas certificadas y estándares para su control.

BIBLIOGRAFIA:
www.mailxmail.com/.../cepas-coleccion-referencia

ruidera.uclm.es. CARACTERIZACIÓN TECNOLOGÍA DE CEPAS; 7: Controles de Cepas

www.mailxmail.com/cepas-colección-referencia; Cepas de colección de referencia

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