La determinación de la calidad bacteriológica reviste gran importancia en el ámbito de la salud pública ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo evitando así epidemias gastrointestinales




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fecha de publicación09.02.2016
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CAMPUS PUERTO ESCONDIDO

ASIGNATURA:

Biología de procariotas

PROFESOR:

M. EN C. francisco Ruíz Ruiz

Trabajo:

Análisis microbiológico del agua para consumo humano

ALUMNOS:

CARLOS ALAN RODRIGUEZ SILVA

Isai Alejandro Bohórquez Martínez

LICENCIATURA EN BIOLOGIA

SEGUNDO SEMESTRE GRUPO 208

PUERTO ESCONDIDO OAX., 24 DE JUNIO DE 2010

PRACTICA # 10

ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AGUA PARA CONSUMO HUMANO
INTRODUCCIÓN:

La determinación de la calidad bacteriológica reviste gran importancia en el ámbito de la salud pública ya que permite garantizar la inocuidad del agua destinada al consumo evitando así epidemias gastrointestinales.

El agua destinada al consumo humano puede ser contaminada por las agua residuales o por desechos humanos y animales que pueden contener microorganismos patógenos (principalmente intestinales) como son los causantes de la tifoidea (Salmonella typhi), la disentería (Shigella dysenterieae) o el cólera (Vibrio cholerae) entre otros.

El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el número de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminación y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma.

La sobrevivencia de los coliformes en el agua es mayor que la de cualquier bacteria que sea enteropatógena y su identificación es fácil y confiable.

Por todo ello, el aspecto más importante del análisis bacteriológico del agua es la determinación de coliformes que puede hacerse por el método del número más probable (NMP) o por el método de filtración de membrana (FM).

Existen otros métodos microbianos que son “indicadores” de otros tipos de contaminación:

Bacterias mesófilas aerobias que reflejan la exposición de la muestra a la contaminación en general, la existencia de condiciones favorables para la multiplicación de microorganismos y la presencia de materia orgánica.

La determinación de bacterias mesófilas aerobias también es rutinaria en el análisis bacteriológico del agua.

Streptococcus de origen fecal, que son más abundantes que los coliformes en el tracto intestinal y heces de los animales, pero sobreviven menos que los coliformes porque prácticamente no se multiplican en el agua, por ello su predominio en el agua indica contaminación fecal proveniente de animales o contaminación relativamente reciente.

Generalmente este tipo de organismos encontrados en aguas residuales son ele resultado de descargas biológicas hechas por seres humanos infectados por estos agentes. Los organismos comunes excretados por el hombre ocasionan enfermedades gastrointestinales como tifoideas, fiebre parasitofoidea, disentería, diarrea y cólera. Debido a su alto poder infeccioso, estos organismos son los responsables de cientos de muertes cada año en zonas donde las condiciones de sanidad ambiental no son adecuadas.

Norma Oficial Mexicana (NOM-127-SSA1-1994) establece que el agua potable debe contener los siguientes caracteres microbiológicos:
_ Hasta 100 bacterias aerobias por ml de agua a 22 ºC.

_ Ausencia total de bacterias coliformes en 100 ml de agua.

_ Ausencia de esporos de clostridios sulfitos reductores en 20 ml de agua.

_ Como límite máximo se permite un contenido total de 200 bacterias aerobias por ml de agua a 37 °C (www.salud.gob.mx/unidades/.../nom/m127ssa14.html).

REALIZACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Para la determinación taxonómica de microorganismos existen pruebas bioquímicas, inmunológicas y moleculares entre otras. El examen y conocimiento de características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas combinadas todas, permiten no solo conocer caracteres fenotípicos útiles para la identificación de los microorganismos, sino también ponen en evidencia sus capacidades que ayudan a explicar propiedades ecológicas de los microorganismos en estudio.
Existen diferentes guías para la interpretación rápida de algunas pruebas bioquímicas, en el siguiente cuadro se exponen una variedad de pruebas bioquímicas y el resultado esperado en el medio de cultivo:



OBJETIVOS:
1.- Aplicar las técnicas de cuantificación más adecuadas para determinar la cantidad de microorganismos en una muestra de agua.
2.-Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua tomadas de los dispensadores ubicados en las instalaciones de la UMAR, mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales y coliformes fecales.

MATERIAL:


1 Autoclave

2 Probeta graduada 100 mL

3 Pipeta graduada 5 mL

5 Matraz Erlenmeyer 250 mL

3 Vaso de precipitados 250 mL

1 Propipeta de llenado simple

1 Piceta 250 mL

1 balanza analítica

1 Gradilla para tubo de ensaye

1 Asa de cultivo de aro

2 Mechero Bunsen

Cinta Parafilm

5 Cajas Petri Desechables estériles

5 Tubos de ensaye de 15*22mm

1 Espátula con punta redondeada

1 Espátula acanalada

2 Varillas de vidrio

2 Jeringa de 10 mL

Tijeras*

1 Jabón antibacterial*

1 Franela*

1 Papel higiénico*

1 Algodón*

1 Cerillos*

1 Encendedor*

1 Cinta Maskintape*

1 Plumón indeleble punto fino y grueso*

Cloro

20 Gasas*

1 Paquete de algodón*

Papel estraza*

Etiquetas*

3 Frascos de jugo de vidrio, vacío y limpio*



*material que deberá de traer el alumno.


METODOLOGÍA:

En cada sesión se deberán de seguir estos tres puntos principales, todo esto para tener un espacio limpio y ordenado, y con ello evitar algún accidente o un mal resultado en las pruebas a realizar.

1.- Limpiar perfectamente el área de trabajo.

2.- Pedir el material de trabajo al responsable del laboratorio, revisándolo cuidadosamente (que se encuentre completo y que no se encuentre sucio o dañado).

3.- Colocar de manera ordenada el material a emplear, además, limpiarlo y secarlo a la hora de entregarlo al encargado de laboratorio al término de la sesión.


PRIMERA SESION: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y SU ESTERILIZACIÓN

DIA 27 DE MAYO DE 2010

En esta sesión se prepararon los medios de cultivo necesarios para la realización del sembrado de bacterias, realizándolo en el siguiente orden.
ACTIVIDAD 1: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

MEDIO DE CULTIVO: CALDO COMUN AGAR MAC-KONKEY SIN CRISTAL VIOLETA

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Bilis de buey

5.0

Suspender 35 g de polvo por litro de agua destilada. Disolver y distribuir 10 ml por tubo con campanita de Durham. Esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.

Peptona

20.0

Lactosa

10.0

Púrpura de bromocresol

0.01


1.- Se prepararon 70ml de medio de cultivo, para lo cual, previamente se realizaron los cálculos convenientes para la preparación del volumen estipulado.

2.- Una ves pesadas las cantidades correspondientes del medio, se procedió a verterlo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, disolviéndolo con la cantidad correspondiente de agua destilada.

3.- Se coloca al fuego el matraz Erlenmeyer, manteniéndolo en movimiento, todo esto, para obtener una mejor dilución de la mezcla.

4.- Posteriormente se prosigue a la repartición del medio a los tubos de ensaye de la siguiente manera: 5 tubos de ensaye con diez mililitros de caldo Mac-konkey, mismos que serán etiquetados de la forma siguiente: 1,2…4,5, (el tubo marcado con el numero uno será ocupado como control de crecimiento).

5.-El sobrante de medio de guarda en un frasco de vidrio.

6.- Se le colocaran tapones de algodón graso envuelto en gasa.

(http://www.scharlau.com/administrador/ebook/57_ES/pdf/Aguas.pdf)
MEDIO DE CULTIVO: AGAR E.M.B.

Fórmula (en gramos por litro)

Instrucciones

  Peptona 

10.0

Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullición durante 1 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar en autoclave a no más de 121°C durante 15 minutos. Enfriar a 45°C y distribuir agitando suavemente.

  Lactosa

5.0

  Sacarosa

5.0

  Fosfato dipotásico

2.0

  Agar

13.5

  Eosina

0.4

  Azul de metileno

0.065


1.- Preparar 70ml de medio de cultivo, para lo cual, previamente se deben de realizar los cálculos convenientes para la preparación del volumen estipulado.

2.- Una ves pesadas las cantidades correspondientes del medio, se procede a verterlo en un matraz Erlenmeyer de 250 ml, disolviéndolo con la cantidad correspondiente de agua destilada.

3.- Se coloca al fuego el matraz Erlenmeyer para obtener una mejor dilución de la mezcla.

4.-Se le colocara un tapón de algodón graso envuelto en gasa. (http://www.scharlau.com/administrador/ebook/57_ES/pdf/Aguas.pdf).

ACTIVIDAD 2: ETERILIZACIÓN

1.- Una ves preparados los medios de cultivo, se procederá a esterilizarlos en la autoclave.

2.- Se esterilizara el material y los medios de cultivo a 121°C durante 15 minutos.

3.- una ves esterilizado el medio, se retira de la autoclave y se realiza el vertido en cinco cajas de petri.
ACTIVIDAD 3: REFRIGERACIÓN Y ENTREGA DE MATERIAL

1.- Una ves enfriado y solidificado los medios de cultivo, serán sellados y se procede a guardarlos en el refrigerador para su posterior uso en las sesiones siguientes.

2.-Se lava el material sobrante y se realiza la entrega al encargado del laboratorio.

SEGUNDA SESIÓN: RECOLECCION DE MUESTRA, SEMBRADO DE BACTERIAS E INCUBACIÓN. DIA 03 DE JUNIO DE 2010

En esta sesión, se recolecto muestras de agua del dispensador que se localiza en las instalaciones de la Universidad del Mar a un costado de la sala de cómputo “c”, así como también se prosiguió al sembrado en los medios de cultivo preparados en la sesión anterior. La sesión de laboratorio se rigió en el siguiente orden.

ACTIVIDAD 1: TOMADO DE MUESTRAS

Previamente se realizo la compra de dos frascos estériles para el tomado de muestras, las cuales se realizaron de la siguiente manera:
A) Preparación de los frascos

B) Toma de la muestra

1. Lavarse las manos y desinfectarlas con etanol al 70%

2. Se desinfecta el grifo de donde se tomara la muestra de agua con algodón y etanol.

3. Dejar correr el agua por 3 minutos, destapar el frasco y tomar la muestra inmediatamente.

4. Generar zona aséptica cuando sea posible hacerlo.

ACTIVIDAD 2: SEMBRADO DE BACTERIAS

PRUEBA PRESUNTIVA

Para la realización del sembrado en los tubos de ensaye, primero organizamos la mesa de trabajo y generamos una zona aséptica con la utilización de mecheros bunsen.

En esta ocasión, el sembrado de bacterias se realizó en la campana de destilación, de la siguiente manera:

1.-Se preparan los tubos para ser inoculados con la muestra de agua.

2.- posteriormente se distribuye en el medio de cultivo de tal forma que en cada tubo se introduzca 1ml de la muestra de agua (cabe mencionar que el tubo marcado con el numero uno no será inoculado con la muestra de agua, ya que servirá como control de crecimiento).
ACTIVIDAD 3: INCUBACIÓN

1.- Una ves terminado de realizar el sembrado en los tubos, se tapan y se prosigue a incubarlos para obtener crecimiento de microorganismos.

2.- Para la identificación de coliformes fecales se incubara a 44°C durante 24-48 horas.

3.- Se dejan en la incubadora hasta obtener crecimiento en los tubos, posteriormente serán retirados y guardados en el refrigerador para su posterior uso.

TERCERA SESIÓN: OBSERVACIÓN DE RESULTADOS, RESEMBRADO DE BACTERIAS, PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA LA REALIZACIÓN DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y ESTERILIZACIÓN. DÍA 10 DE JUNIO DE 2010
En esta sesión se realizó la observación macroscópica y microscópicamente de microorganismos crecidos en los medios de cultivo, así como también se realizaron tinciones Gram y se realizo el resembrado en placas con medio EMB, cabe destacar que este medio, es un medio diferencial con lo cual podemos obtener microorganismos característicos como coliformes, con lo cual podemos asegurarnos que los microorganismos ahí crecidos serán coliformes únicamente.
ACTIVIDAD 1: OBSERVACIÓN DE RESULTADOS

Se realizo la observación microscópica y macroscópica de los tubos de ensaye donde se obtuvo crecimiento bacteriano (Para este caso, obtuvimos crecimiento en todos los tubos sembrados).

Para lo cual se realizaron tinciones Gram, observándose lo siguiente:


Muestra de agua teñida por el método de tinción Gram, dando como resultado negativo.

ACTIVIDAD 2: RESEMBRADO EN PLACAS EMB

PRUEBA CONFIRMATIVA

1.-En los tubos donde se observan resultados positivos de la prueba presuntiva, se introduce un asa de siembra estéril y se toma una porción que va a sembrarse en estría en una placa Petri con medio EMB.

2.-Para este paso deberá apropiarse la zona de trabajo de tal manera de crear una zona de seguridad y de asepsia.

3.-Se incuban las cajas de 24 - 48 horas a la temperatura correspondiente.


ACTIVIDAD 3: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA LA REALIZACIÓN DE

PRUEBAS BIOQUÍMICAS
El examen y conocimiento de características morfológicas, bioquímicas y fisiológicas combinadas todas, permiten no solo conocer caracteres fenotípicos útiles para la identificación de los microorganismos, sino también ponen en evidencia sus capacidades que ayudan a explicar propiedades ecológicas de los microorganismos en estudio.

Por tal motivo es de vital importancia la realización de pruebas bioquímicas, ya que con ello se llega a la identificación del microorganismo problema.

Para esta práctica las pruebas bioquímicas realizadas fueron las siguientes:

Fermentación de carbohidratos Prueba de la catalasa Licuefacción de la gelatina Prueba de motilidad Producción de H2S

ACTIVIDAD 4: ESTERILIZACIÓN

1.- Se esterilizó el material preparado para la realización de las pruebas bioquímicas; cabe mencionar que, además de las pruebas bioquímicas, se preparo Agar nutritivo para el resembrado de la cepa “X” misma que fue proporcionada por el profesor en el laboratorio. Todo esto con la intención de poder obtener una cepa pura.
2.- Esperamos a que solidificara el medio para posteriormente ser guardados en el refrigerador.



El material será guardado en el refrigerador para su conservación

Autoclave lista para usarse

CUARTA SESIÓN: OBSERVACIÓN DE RESULTADOS, RESEMBRADO EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y ESTERILIZACIÓN EN SUCIO. DIA 17 DE JUNIO DE 2009

ACTIVIDAD 1: REALIZACIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS
1.- De todos y cada uno de los tubos y placas donde existió crecimiento, se analizara con cada una de las pruebas bioquímicas previamente estipuladas, así como también se realizaron tinciones, dando como resultado lo siguiente:

Estas imágenes fueron tomadas en el laboratorio de biología con el “microscopio de contraste”, con la idea de obtener mejores resultados al observarlo, ya que dicho microscopio tiene una buena resolución. Pero por algún motivo no se pudieron obtener imágenes nítidas.





FERMENTACION DE CARBOHIDRATOS

PRUEBA DE LA CATALASA

LICUEFACCIÓN DE GELATINA

PRUEBA DE MOTILIDAD

PRODUCCION DE H2S



Muestra de agua



-------------



POSITIVO
Se observa la presencia inmediata de burbujas



-------------



-------------



-------------




Muestra de agua

Positivo
se observan colonias de color amarillo



-------------



-------------



-------------



-------------


Muestra de agua


-------------


-------------

NEGATIVO

En nuestro

medio de

cultivo no

obtuvimos

crecimiento


-------------


-------------

Muestra de agua


-------------


-------------


-------------

Esta prueba no se llevo acabo debido a una mala reacción del medio de cultivo.


-------------


Muestra de agua


-------------


-------------


-------------


-------------

NEGATIVA
no se

obtuvo

crecimiento




ACTIVIDAD 2: ESTERILIZACION EN SUCIO.

1.- Preparar el material para esterilizar. La esterilización se realizara en la autoclave a una temperatura de 121°C durante 15 minutos.

2.- Retirar el material de la autoclave para su posterior lavado.

3.- Entrega de material limpio y seco al encargado de laboratorio.

4.- Lavar la autoclave.
ACTIVIDAD 3: LAVADO Y ENTREGA DE MATERIAL
1.-Una vez terminado los procesos de identificación bacteriana, se prosigue a el lavado del material y su posterior entrega al encargado del laboratorio.

CONCLUSION:

La identificación de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes.

Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.

 Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc.
BIBLIOGRAFIA

http://www.scribd.com/doc/7262714/Analisis-Microbiologico-de-Muestras

http://www.condalab.com/industrias/aguas.html

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/maconkeycaldo.htm

http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/embagar.htm

http://www.scharlau.com/administrador/ebook/57_ES/pdf/Aguas.pdf

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