Manual de prácticas de microbiología general




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1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea, Citrato y MIO

2. Inocule una serie para cada cepa como sigue:

MEDIO FORMA DE INOCULAR

TSI Superficie - picadura

LIA Superficie - picadura

Citrato de Simmons Superficie

Agar Urea Superficie

MIO Picadura

3. Tape los tubos procurando no apretar demasiado los tapones

4. Incube a 35° C por 24 hrs.

5. Lea e interprete los resultados de acuerdo a las tablas de identificación

PRESENTACÍON DE RESULTADOS

1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y después de inocular), utilizando los colores apropiados.

2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioquímicas, especifique de que bacteria se trata.



PRÁCTICA # 6

CONTROL BACTERIANO POR MEDIO DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS


OBJETIVO

Observar el efecto de algunos agentes físicos y químicos utilizados como germicidas para el control de los microorganismos.

GENERALIDADES


Muchas prácticas de la vida cotidiana como la potabilización del agua, la pasteurización de la leche o la refrigeración de los alimentos, tienen por objeto controlar a las poblaciones microbianas. Este control tiene varias razones como prevenir la transmisión de enfermedades, evitar la contaminación de algunos productos y evitar la contaminación (alimentaria, ambiental, etc.)

Una variedad de agentes físicos y químicos son útiles para provocar la muerte bacteriana o para prevenir su multiplicación. Entre estos encontramos las radiaciones ultravioleta, la temperatura, los agentes desinfectantes y otros.

RADIACIÓN ULTRAVIOLETA


La mayoría de los microorganismos mueren bajo grandes dosis de radiación electromagnética, especialmente en la zona ultravioleta (UV), ondas ultrasónicas de muy alta frecuencia y con pequeñas dosis de radiación ionizante, como los rayos gamma y rayos catódicos. La muerte se presenta por los daños causados al DNA y la variación en la resistencia, normalmente reflejada en las diferentes facultades de las células para reparar el DNA dañado por la radiación.

TEMPERATURA


Muchas células son sensibles al calor húmedo, después de la exposición por algunos minutos a una temperatura más elevada que su máxima de crecimiento. La proporción de células muertas depende del tiempo de exposición y la temperatura.

El calor mata causando la desnaturalización de las macromoléculas como las proteínas, la muerte bacteriana es proporcional al grado de coagulación provocado por el calor húmedo.

La destrucción efectiva por temperaturas bajas rara vez ocurre. La causa del daño celular durante el congelamiento no es muy conocida, pero se sabe que la concentración de solutos durante el congelamiento rompe las membranas y causa la lisis durante el deshielo.

DESINFECTANTES


Los desinfectantes son generalmente agentes químicos que matan a las bacterias y otros microorganismos. Dentro de estos tenemos:

1. Ácidos y álcalis> Tanto los ácidos y álcalis son muy bactericidas dado su grado de disociación. Entre estos se puede mencionar KOH, NaOH, HNO3 y H2SO4.

2. Agentes oxidantes. Entre éstos tenemos el cloro, el peróxido de hidrógeno, perborato de Sodio, Permanganato de Potasio y Cloruro de Calcio. Los cuales actúan oxidando las moléculas esenciales de la célula.

3. Compuestos orgánicos. Como los derivados del alquitrán de hulla, el cresol, tricresol, alcanfor, creosota, ácido fénico y el fenol que es el de uso más común. Actúan precipitando las proteínas. Esta acción guarda relación con la destrucción de la estructura de la membrana y sus funciones.

4. Detergentes. Éstos se dividen en tres grupos

a) compuestos aniónicos como las sales sódicas y potásicas de ácidos grasos de peso molecular elevado sulfatos de alquilo y los jabones.

b) compuestos catiónicos como los compuestos de amonio cuaternario y el cloruro de benzalconio.

c) compuestos no iónicos que incluyen poliésteres y ésteres de poliglicerol.

Los jabones no pueden considerarse antisépticos o desinfectantes efectivos puesto que solo son agentes que eliminan las bacterias mecánicamente de la piel por emulsión de secreciones lipoides en las cuales están incluidos los microorganismos.

Los otros grupos de desinfectantes se consideran bactericidas porque destruyen la integridad de la membrana por alteración de la interacción entre las proteínas y lípidos. Los detergentes catiónicos son los más eficaces debido a la interacción de la molécula del detergente (carga positiva) con la superficie de la membrana bacteriana (carga neta negativa)

ACCIÓN OLIGODINÁMICA


Acción oligodinámica es la propiedad antibacteriana que presentan ciertos metales pesados en cantidades de partes por millón (ppm), lo cual se debe a la formación de sales pobremente disociables con los grupos sulfhidrilos de las proteínas.

EFECTO DE LA TEMPERATURA


El efecto de la temperatura en la eliminación de bacterias se ilustrará con un ejercicio en el cual se calentarán los tubos con una suspensión de la bacteria a estudiar por diferentes tiempos, evaluando después el efecto por conteo de células vivas.

MATERIAL Y EQUIPO

Asa bacteriológica

2 mecheros Bunsen

1 vaso de precipitado de 250 ml

Tela de asbesto

15 tubos de 13 x 100 con tapón de rosca, estériles

3 tubos de con10 ml solución salina estéril

3 pipetas de 5 ml estériles

1 asa calibrada de 0.001 ml

15 placas de agar de soya y tripticaseína

Cepas de Staphylococcus aureus, Escherichia coli (24 hrs incubación), Bacillis subtilis (48 hrs de incubación).

TÉCNICA

  1. Prepare una suspensión ligera de cada bacteria (con la misma turbidez todas).

  2. Deposite 1 ml de cada suspensión en 5 tubos para cada bacteria, los cuales irán marcados con el tiempo de calentamiento (sin calentamiento, 5, 10, 15 y 20 minutos respectivamente).

  3. Caliente los tubos en un baño de agua de ebullición constante por los tiempos indicados 5, 10, 15 y 20 minutos y deje un tubo de cada bacteria sin calentar.

  4. Después del calentamiento siembre con el asa calibrada una asada de cada suspensión en las cajas marcadas para cada bacteria con el tiempo de exposición (5 cajas para cada bacteria).

  5. Incube por 24 horas y cuente cuantas colonias crecen en cada placa para poder estimar el efecto del tiempo de exposición en cada caso.

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

  1. Elabore una curva con el número de bacterias por ml (y) vs el tiempo de exposición (x).

  2. Concluya cual es el tiempo mínimo de exposición para eliminar al 50% de cada una de las bacterias estudiadas.


ACCIÓN DE LOS METALES, CLORO, ÁLCALIS Y ÁCIDOS


Para demostrar el efecto de los metales sobre los microorganismos se utilizarán soluciones de los compuestos en cuestión que se aplicaran sobre el medio para que se difundan. Midiendo posteriormente el halo de inhibición producido por cada una.

MATERIAL Y EQUIPO

Asa bacteriológica

Mechero Bunsen

2 cajas de Petri estériles

2 tubos con 20 ml de agar nutritivo fundido

Cepas de Sarcina lutea, Pseudomonas aeruginosa

Cajas Petri con discos de papel filtro impregnados con las siguientes soluciones:

- Solución de Cloruro de Plata 0.4%

- Cloruro mercúrico 0.4%

- Acido sulfúrico 10%

- Hidróxido de Sodio al 10%

- Cloro 6%

- Fenol al 5%

- Benzal

Pinzas para sensidiscos

TÉCNICA

1. Inocular con cada cepa un tubo de agar nutritivo fundido y enfriado alrededor de 45 por separado.

2. Verter en una caja Petri estéril y dejar solidificar sobre una superficie nivelada.

3. Colocar un disco impregnado con cada solución en forma equidistante sobre las placas.

4. Dejar reposar 5 minutos para que se absorban las soluciones.

5. Incubar a 35 C por 24 hrs y observar la formación de halos de inhibición de crecimiento.

PRESENTACION DE RESULTADOS

1. Mide los halos de inhibición de crecimiento.

2. Menciona qué solución es más eficaz.

PRÁCTICA # 7

OBSERVACIÓN EN FRESCO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BUCALES



OBJETIVO


El alumno aplicará los conocimientos obtenidos en el curso para identificar los microorganismos que habitan en la microbiota bucal.

GENERALIDADES


La identificación de bacterias es un trabajo un tanto detectivesco en el cual se deben reunir todas las características que se puedan obtener en el laboratorio como morfología colonial en medios selectivos o de uso general, morfología microscópica y coloración de Gram, etc.

La composición de la microbiota bucal varía desde el nacimiento y durante toda la vida influenciada por el desarrollo de la biopelícula dental, primero por la adherencia microbiana mediada por distintos mecanismos; a la adhesión de los primeros colonizadores le siguen fenómenos de coagregación, lo que constituye el denominado "mosaico de microorganismos", el cual varía de acuerdo con las propiedades biológicas y físicas del sitio.

El conocimiento de la ecología de la cavidad bucal permite determinar el proceso que involucra, fundamentalmente, la etiopatogenia de la caries dental y por consecuencia, su prevención: también contribuye a identificar las complicaciones sistémicas por la microbiota bucal.
MATERIAL Y EQUIPO

3 portaobjetos

1 cubreobjetos

1 tubo de ensaye de 13 X 100 con tapón de rosca con solución salina estéril

1 placa agar nutritivo

1 placa agar EMB

1 placa agar sal y manitol

1 placa agar Mac Conkey

Hisopos estériles

Puente de tinción

Cristal violeta

Yodo de Gram o lugol

Etanol al 95% o alcohol acetona

Safranina

Aceite de inmersión

Mechero

Microscopios

TÉCNICA

1. Tomar una muestra de alrededor de los dientes incluyendo las encías con un hisopo estéril, sembrar en las placas de agar nutritivo, EMB, MacConkey y sal y manitol. Incubar a

36° C por 24 horas. Anotar resultados y observaciones.

2. Con el otro hisopo tomar nuevamente muestra y realizar 2 extendidos e introducir el hisopo en el tubo con sol. salina estéril.

3. Los extendidos secarlos con ayuda del mechero y proceder a teñir como indica la técnica de Gram.

4. Observar al microscopio con objetivo de 100 X.

5. Tomar una muestra con el hisopo en solución salina, colocarla en el portaobjetos y cubrir. Observar en 40 X.
PRESENTACIÓN DE RESULTADOS

1. Investigar los microorganismos de la microbiota bucal, así como las características morfológicas en cada medio y microscópicas tintoreales.

2. Anotar resultados y observaciones de las extensiones y de crecimiento en las placas de agar, obtenidas en la práctica.

3. Anotar los géneros que crecieron en cada placa.
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