Manual de prácticas de microbiología general




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MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIÓN DE LABORATORIO


1. Bata de laboratorio limpia, de manga larga, con botones.

2. El protocolo de la práctica y la bitácora de laboratorio.

3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, maskin tape, marcador indeleble o etiquetas pequeñas.

4. Lentes de seguridad.

5. Jabón y toalla individual.



Contenido


REGLAS DE LABORATORIO 3

NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO EN LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA 3

MATERIALES INDISPENSABLES EN CADA SESIÓN DE LABORATORIO 4

PRÁCTICA # 1 5

MICROSCOPÍA 5

OBJETIVO 5

INTRODUCCIÓN 5

EL MICROSCOPIO 6

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO 7

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES 8

ACTIVIDADES 8

PRÁCTICA # 2 9

TÉCNICAS DE TINCIÓN 9

OBJETIVO 9

GENERALIDADES 9

TINCIÓN DE BACTERIAS 10

TIPOS DE TINCIÓN 10

TINCIÓN SIMPLE 10

TINCIÓN NEGATIVA 11

TINCIÓN DE GRAM 11

TINCIÓN DE ESPORAS 12

PRACTICA # 3 16

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO 16

GENERALIDADES 16

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 16

MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS 18

PRÁCTICA # 4 19

MORFOLOGÍA DE LAS COLONIAS BACTERIANAS 19

PRÁCTICA # 5 24

PRUEBAS BIOQUÍMICAS 24

OBJETIVO 24

El alumno observará algunas reacciones bioquímicas relacionadas con la fisiología bacteriana, a la vez aprenderá su utilización para la identificación de enterobacterias 24

GENERALIDADES 24

El estudio bioquímico que se lleva a cabo como complemento de otros estudios bacteriológicos es posible gracias a las reacciones fisiológicas y químicas que llevan a cabo los microorganismos. Para esto se emplean medios de cultivo enriquecidos con productos útiles para el metabolismo celular, los cuales además contienen algún indicador que hace cambiar el color del medio al efectuar dichos microorganismos sus funciones. 24

Los organismos varían en su capacidad para utilizar diferentes compuestos (por ejemplo: carbohidratos, urea, citrato, etc.) para algunos microorganismos que se usan en su identificación en el laboratorio. De acuerdo a los productos de su actividad química, las bacterias se pueden clasificar como: 24

1. Zimógenas: las que fermentan los carbohidratos, desdoblándolos en alcohol, ácido láctico o acético. 24

2. Aerógenas: las que producen gas como hidrógeno y dióxido de carbono como resultado de su actividad metabólica. 24

3. Anaerógenas: las que no producen cantidades visibles de gas durante su actividad metabólica. 24

4. Cromógenas: las que producen pigmentos solubles o insolubles. 25

5. Fotógenas: las que causan putrefacción y producen una débil fosforescencia (algunas bacterias marinas) 25

Entre las pruebas bioquímicas más comunes tenemos: 25

Caldos de carbohidratos con indicador de pH, rojo de fenol: Al fermentar algunos carbohidratos, muchas bacterias producirán ácido, y con un medio con pH original alrededor de 7.4 al bajar éste a 6.8 por el ácido que produce un cambio de color gracias a la incorporación de un indicador de pH como es el rojo de fenol. 25

Agar de hierro y triple azúcar (TSI) 25

El agar TSI es uno de los más usados para ver la fermentación de carbohidratos en la familia Enterobacteriaceae. Se pueden tener varias posibilidades de fermentación de acuerdo a las características metabólicas del microorganismo como son: Utilización de glucosa sola. Los microorganismos que fermentan solo la glucosa provocan en este medio una reacción alcalina en la superficie ( roja) sobre un fondo ácido (amarillo, k/a) debido a que realizan una degradación aeróbica de la glucosa en la superficie, convirtiendo el piruvato en agua y dióxido de carbono. Después de 18 a 24 horas de incubación como la concentración de glucosa es baja (0.1%), los microorganismos empiezan a utilizar las peptonas que se encuentran en el medio, causando la liberación de amoniaco y produciendo un pH alcalino ( rojo) gracias al rojo de fenol que tiene el medio como indicador de pH. En el fondo, como no hay oxígeno, se realiza una degradación anaeróbica y el piruvato se convierte en lactato con lo cual el pH disminuye quedando el pH ácido ( amarillo). 25

Utilización de lactosa y/o sacarosa. Algunos microorganismos tienen la facultad de fermentar la glucosa y la lactosa resultando una reacción ácida en la superficie (amarilla) y ácida en el fondo (amarilla, a/a). En este caso después de 18 a 24 hrs como la concentración de lactosa es alta (1.0%), o sea 10 veces más que la de la glucosa presente, no se ha utilizado completamente y la acidez persiste tanto en el fondo como en la superficie. En el caso de usar sacarosa la reacción sería la misma. 25

Sin utilización de ninguna de las anteriores. En el caso de no utilizar ninguno de los carbohidratos presentes (glucosa, lactosa y sacarosa), lo que se usaría serían las peptonas, ya sea aeróbicamente o anaeróbicamente. Sólo utilizándolas aeróbicamente daría una superficie alcalina (roja, k) sobre un fondo sin cambio (sc) o sea k/sc). Si las usara aeróbicamente daría una superficie alcalina (rojo) sobre fondo alcalino (rojo) o sea k/k. 26

En este medio también es posible detectar la producción de gas por la formación de burbujas dentro del medio, y la producción de ácido sulfhídrico, el cual reaccionará con un indicador con base de fierro dando un color negro debido al sulfuro de hierro formado. 26

Agar de hierro y lisina (LIA) 26

Algunos microorganismos son capaces de provocar la descarboxilacidon de los aminoácidos por inducción de enzimas específicas, el resultado de esta descarboxilación es la produccidon de una amina ( o diamina) y dióxido de carbono. Tal es el caso de la produccidon de la enzima lisina descarboxilasa la cual al actuar sobre la lisina produce una diamina llamada cadaverina. 26

En el medio LIA se puede detectar la producción de la lisina descarboxilasa ya que se produce una reacción coloreada por un cambio en el pH del medio, que contiene como indicador púrpura de bromocresol. Un cambio del color original del medio (morado) hacia amarillo en el fondo indica una reaccidon ácida por la fermentación de una pequeña cantidad de glucosa en el medio. Si el microorganismo produce lisina descarboxilasa, la acción de esta enzima sobre la lisina dará lugar a la cadaverina, la cual provocará un cambio de pH hacia la alcalinidad dando un color morado que sobrepasa la acidez debida a la glucosa. Así pues, un fondo amarillo indica que no se produce lisina descarboxilasa y un color morado que si es producida. 26

Prueba del citrato de Simmons 26

Ciertas bacterias tienen la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono en una serie de reacciones como sigue: 26

CITRATO OXALACETATO + ACETATO 26

OXALACETATO PIRUVATO + CO 26

2 PIRUVATO ACETATO + LACTATO + CO 26

Los ácidos orgánicos son posteriormente utilizados dando como producto final carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El pH alcalino así logrado hace que el indicador de pH en el medio, el azul de bromotimol vire de su color verde original a un azul intenso. 26

Prueba de la ureasa 26

La hidrólisis de la urea es catalizada en algunos microorganismos por una enzima específica, la ureasa, dando lugar a dos moléculas de amonio, agua y dióxido de carbono. 27

Todo esto da lugar a un cambio en el pH, lo que causa que cambie el color original del medio (amarillo) a un color rojo bugambilia por el indicador rojo de fenol. De acuerdo a la degradación de la urea el color será más o menos intenso. 27

(NH2)2C=O + 2H2O---> CO2+2NH3+H2O (NH4)2CO3 27

Medio MIO (Movilidad, Indol y Ornitina) 27

Este medio como su nombre lo indica sirve para observar la movilidad, la produccíon de indol y descarboxilación de la ornitina. 27

La movilidad se detectará por la presencia de turbidez alrededor del punto de inoculación. 27

El indol se formará si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima triptofanasa que desdoblará el aminoácido triptófano en indol, ácido pirúvico y amonio. El indol es incoloro pero al reaccionar con el reactivo de Kovacs (p-dimetil-aminobenzaldehido) que se adiciona después de que creció la bacteria, dará un color rojo violeta. 27

Por lo que respecta a la descarboxilacíon de la ornitina como el medio tiene púrpura de bromocresol y una pequeña cantidad de glucosa cuando esta se fermenta se produce un color amarillo en el fondo (ornitina descarboxilasa negativa), sin embargo al descarboxilarse la ornitina se produce putresina la cual es alcalina y sobrepasa la acidez dada por la fermentación de las glucosa resultando en un color morado en el fondo 27

MATERIAL Y EQUIPO 27

Aguja bacteriológica 27

Mechero de Bunsen 27

Gradilla 27

Medios de cultivo (4 tubos cada uno) 27

Agar de hierro y triple azúcar (TSI) 27

Agar de hierro y lisina (LIA) 27

Agar Citrato de Simmons 27

Agar Urea según Christensen 27

Medio de MIO 27

TÉCNICA 27

1. Marque perfectamente cada uno de sus tubos, usando una serie de TSI, LIA, Urea, Citrato y MIO 28

2. Inocule una serie para cada cepa como sigue: 28

MEDIO FORMA DE INOCULAR 28

TSI Superficie - picadura 28

LIA Superficie - picadura 28

Citrato de Simmons Superficie 28

Agar Urea Superficie 28

MIO Picadura 28

3. Tape los tubos procurando no apretar demasiado los tapones 28

4. Incube a 35° C por 24 hrs. 28

5. Lea e interprete los resultados de acuerdo a las tablas de identificación 28

PRESENTACÍON DE RESULTADOS 28

1. Anote las observaciones de cada tubo (antes y después de inocular), utilizando los colores apropiados. 28

2. Anote los resultados de cada prueba usando las abreviaturas correctas. En caso de no corresponder a la bacteria que se le dio con el resultado de sus pruebas bioquímicas, especifique de que bacteria se trata. 28

PRÁCTICA # 6 29

CONTROL BACTERIANO POR MEDIO DE AGENTES FÍSICOS Y QUÍMICOS 29

GENERALIDADES 29

RADIACIÓN ULTRAVIOLETA 29

TEMPERATURA 30

DESINFECTANTES 30

PRÁCTICA # 7 34

OBSERVACIÓN EN FRESCO Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS BUCALES 34

OBJETIVO 34

GENERALIDADES 34

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