Manual de prácticas de microbiología general




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PRACTICA # 3

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO


OBJETIVO

El alumno aprenderá las técnicas básicas para preparar un medio de cultivo.

GENERALIDADES


Las bacterias al igual que otros microorganismos requieren para su crecimiento de una fuente de energía exógena y nutriente esenciales tales como agua, carbón, nitrógeno, minerales y factores de crecimiento, además de las condiciones ambientales apropiadas como son pH, temperatura, presión osmótica y oxígeno atmosférico. Cuando las bacterias se cultivan en el laboratorio tales requerimientos se llenan con los medios de cultivo los cuales pueden ser de muy variados tipos de acuerdo al microorganismo que se desee estudiar. Muchos materiales naturales como jugos, leche, vegetales y carnes pueden ser usados como bases para medios de cultivo.

El medio de cultivo puede ser líquido como los caldos, semisólido o sólido dependiendo de la consistencia que adquiere el medio líquido al agregar diferentes concentraciones de un solidificante como el agar, que es un extracto de algas marinas. El agar no es utilizado como nutriente por la mayoría de las bacterias, así pues actúa solamente como solidificante. Se funde alrededor de 100° C y permanece líquido hasta que se enfría de 42° a 43°C. La gelatina se puede usar también pero con el inconveniente de que funde a 25°C y puede ser hidrolizada por muchas bacterias.

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO


Existen diversas clasificaciones de los medios de cultivo: se abocará a dos de uso práctico, una de acuerdo a su composición y la otra de acuerdo a su uso en el laboratorio:

A) Clasificación de los medios de cultivo de acuerdo a su composición:

+ Sintéticos. Son aquellos medios preparados con alta pureza y en los cuales la composición se conoce en forma precisa. Su uso es muy definido, por ejemplo medios para ensayo de vitaminas o para enriquecimiento.

+ No sintéticos. Estos se preparan a partir de una gran variedad de productos crudos como son extractos de carne, extractos de levaduras, hidrolizados proteicos (peptonas) etc. y aunque se conoce cuáles son los ingredientes, estos pueden variar ligeramente, por ejemplo el contenido de aminoácidos entre la carne de un animal y otro.

B) Clasificación de los medios de acuerdo a su uso en el laboratorio

~ Medios de cultivo de uso general. En este grupo se encuentran los medios qe contienen los nutrientes básicos y no contienen sustancias inhibitorias por lo que en ellos pueden crecer una gran variedad de heterótrofos. Entre estos medios tenemos Agar de soya y tripticaseína, agar de Müller Hinton, agar nutritivo, etc.

~ Medios de cultivo diferencial. Este tipo de medios es usado para distinguir entre diferentes tipos de bacterias. Usualmente contienen colorantes o indicadores de pH que darán un color característico a las colonias o viraran el color del medio de cultivo de acuerdo al microorganismo que se trate.

Un medio puede ser diferencial y selectivo al mismo tiempo.

~ Medios de cultivo selectivos. Este es un medio nutritivo al que se le añaden productos que actúan como agentes inhibitorios, de tal manera que sólo permiten el crecimiento de cierto grupo de microorganismos. Se usan para aislar organismos particulares e inhibir el crecimiento de los no deseados.

Entre los medios selectivos y diferenciales tenemos:

Agar de MacConkey el cual contiene una mezcla de sales biliares que inhiben a los microorganismos Grampositivos, además de lactosa y como indicador rojo de fenol para distinguir las bacetrias que fermentan la lactosa de las que no lo hacen.

Agar EMB (Eosina azul de metileno) mediante el azul de metileno y la eosina inhibe los organismos Grampositivos. Al mismo tiempo, al igual que el Agar de MacConkey, permite diferenciar bacterias que fermentan la lactosa y/o a la sacarosa de las que no lo hacen.

El Agar de sal y manitol, por su alto contenido de NaCl (7.5%) inhibe a las bacterias que no lo toleran, al mismo tiempo con el indicador rojo de fenol sirve para detectar la fermentación del manitol. Se utiliza para el aislamiento y diferenciación del género Staphylococcus.

MEDIOS DE CULTIVO DESHIDRATADOS


Hasta 1930 la preparación de medios de cultivo requería de mucho tiempo ya que se debía de partir de materiales crudos que se iban pesando individualmente y algunos se tenían que preparar como las infusiones y extractos por métodos muy tediosos. Sin embargo, ahora se cuenta con medios de cultivo deshidratado que han simplificado mucho el trabajo ya que solo hace falta leer las instrucciones en cada frasco, disolver la cantidad necesaria en agua, ajustar el pH, dispensar en tubos y esterilizar.

DISOLUCIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Para disolver los medios de cultivo deshidratados se debe utilizar agua recién destilada o desmineralizada con un pH lo más cercano posible a 7.0. El recipiente que se utilice debe ser de preferencia un matraz Erlenmeyer con una capacidad mayor al volumen de medio que se va a preparar para que se pueda agitar fácilmente. Los medios que no contienen agar se pueden disolver fácilmente en agua fría o con un ligero calentamiento, sin embargo si el medio contiene agar o gelatina requerirá de calentamiento.

AJUSTE DEL pH

Si se utiliza agua neutra y un medio deshidratado de buena calidad el pH del medio usualmente quedará dentro de los límites adecuados, aún así es conveniente ajustar el pH lo que se puede hacer con un potenciómetro o en su defecto con papel pH 4.0-7.0.

Si el medio es sólido la medición y el eventual ajuste se hace a 45°-50°C ( aún está liquido) y en los medios líquidos se hace a temperatura ambiente. La corrección del pH se efectúa con HCl o NaOH 1N o 0.1 N tomando una muestra del medio de cultivo preparado y estéril, se mide el pH y si fuera necesario se ajusta en la muestra calculando después el volumen de ácido o base que sea requerido para el total de medio.

ESTERILIZACIÓN

Los medios que van en tubo se pueden esterilizar directamente en los tubos; en el caso de los medios en cajas de Petri se pueden esterilizar en tubos con el volumen para vaciar una placa (aprox. 20 ml cada uno) o bien matraces para varias placas.

Si en las instrucciones del medio no se indica otra cosa, la esterilización se lleva a cabo en autoclave a 121C por 15 minutos.
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