 Año: 2015
6°2°, 6°3° y 6°5°
TRABAJOS PRÁCTICOS DE TECNOLOGIA DE LOS ALIMENTOS
Manual Teórico - Práctico de la asignatura
Tec. Gastón Siano
Escuela Técnica N°27 D.E. N° 18 Hipólito Yrigoyen
Trabajo Práctico n°1: Fundamentos de Microbiología General
Objetivos: Poner en práctica las técnicas básicas de un laboratorio de microbiología
La esterilización es el procedimiento que elimina todos los seres vivos, incluyendo sus formas esporuladas. Según el método empleado, el procedimiento se clasifica en métodos físicos, químicos, biológicos o mixtos.
Calor seco: destruye a los microorganismos por oxidación de sus componentes celulares
Fuego directo: Para objetos metálicos, por calentamiento directo a la llama del mechero.
Aire caliente: Para material de vidrio, no resistente al fuego directo, en estufas.
Calor húmedo: el cual destruye a los microorganismos por desnaturalización de las proteínas
Vapor a presión: Se emplea autoclave donde se esterilizan medios de cultivo, gomas, etc.
Vapor fluente: Se emplea autoclave con la salida de gases abierto. Se emplea para esterilizar productos poco contaminados y termosensibles, como por ejemplo, productos azucarados.
Tyndalización: Empleada para sustancias termosensibles. Se puede usar la temperatura de 100°C o menor según que producto se trate. Si se emplea 100°C , se calienta a esa temperatura el producto durante 30 minutos, luego de 24 horas, se vuelve a calentar a 100°C, eliminando las formas vegetativas que han desarrollado a partir del primer calentamiento cuando esporularon. Luego del tercer calentamiento, transcurridas las 48horas, se considera que el producto está estéril.
Radiación: puede ser utilizada como agente para la inactivación de microorganismos por su efecto sobre los ácidos nucleicos principalmente
Ionizantes: son altamente penetrantes, lo que permite esterilizar grandes volúmenes. Éstas actúan ionizando moléculas a su paso y no producen aumento de temperatura, por lo que también se llaman esterilizaciones en frío.
No ionizantes: sólo pueden ser utilizadas para esterilización de superficies, ya que no son penetrantes por su baja energía (ej. luz ultravioleta o infrarroja).
Ultrasonido: Se basa en un dispositivo electrónico de frecuencia extremadamente alta de ondas ultrasónicas.
Los términos desinfectantes y antisépticos se emplean para denominar sustancias químicas llamadas bactericidas (matan las bacterias) o bacteriostáticas (inhiben su crecimiento y multiplicación). El mismo compuesto puede actuar de bactericida o de bacteriostático, dependiendo de la concentración de uso. Estos agentes actúan por medio de coagulación de proteínas, inactivación de enzimas, rotura de la membrana celular, modificación química de la superficie bacteriana, entre otras formas. Los productos usados generalmente son fenoles, halógenos, sales de amonio cuaternarias, etc.
También pueden usarse sustancias gaseosas, como el óxido de etileno, empleado generalmente para material descartable.
Como se dijo anteriormente también hay métodos biológicos para esterilizar. En los mismos se utiliza alguna cepa bacteriana determinada para impedir el crecimiento de otros microrganismos por competencia de nutrientes. También tenemos otros métodos que son mixtos en los cuales se combinan dos o más técnicas de las antes estudiadas.
Parte 2: Medios de Cultivo para crecimiento de microrganismos
Los medios de cultivo son un conjunto de sustancias que favorecen el crecimiento de los mismos. En estos medios se deben incluir todos los nutrientes necesarios para el desarrollo de los microrganismos. Teniendo en cuenta su aplicación los medios de cultivo se clasifican según:
Medios de enriquecimiento: favorecen el crecimiento de los MO en general que están en escaso número y aumentan la proporción de los organismos buscados
Medios selectivos: por medio del agregado de agente inhibidores se restringe el crecimiento de ciertos microrganismos, favoreciendo el desarrollo de otros
Medios diferenciales: Con la incorporación de reactivos y/o productos químicos se induce a cambios en el crecimiento bacteriano que permiten apreciar diferencias entre tipos bacterianos.
A los medios de cultivo líquidos se les puede adicionar agar agar, un gelificante (polisacárido) proveniente de algas marinas, que tiene la propiedad de actuar si éste es llevado al punto de ebullición del medio en el que se encuentra para poder luego solidificar en frío. De acuerdo a la cantidad de agar que contiene el medio de cultivo, éstos se clasifican en:
Líquidos: con 90% - 95% de agua, sin agar
Semisólidos: con 0,1% - 0,3% de agar
Sólidos: con 1,5 a 2% de agar
Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son:
Agar. Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.
Azúcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa, etc.
Extractos. Son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.
Peptonas. Son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales.
Fluidos corporales. Sangre completa, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos.
Buffers: Son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano.
Ej.: fosfatos bisódicos o bipotásicos.
Indicadores de pH. Son indicadores ácido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio.
Agentes reductores. Sustancias que se añaden al medio para crear las condiciones que permitan el desarrollo de los gérmenes microaerófilos o anaerobios. Ej.: cisteína y tioglicolato.
Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc. que a determinadas concentraciones en el medio actúan como agentes selectivos frente a determinados microorganismos.
Parte 3: Métodos para aislamiento de cultivos bacterianos puros
En términos microbiológicos se entiende por siembra el proceso mediante el cual se lleva una porción de una población de microorganismos (inóculo) de un cultivo bacteriano a un medio nutritivo para su crecimiento. Un cultivo puro es aquel que contiene una sola clase de microorganismos. Para obtenerlo es necesario recurrir a las llamadas técnicas de aislamiento. Aunque existen otras, las técnicas más utilizadas emplean un medio de cultivo sólido, en el que los microorganismos generan colonias separadas. Se puede demostrar que cada colonia procede de una sola célula o de un grupo de células del mismo tipo si el microorganismo forma agregados. Por ello lo más correcto es hablar de unidades formadoras de colonias (UFC) al referirnos al origen de una colonia. Por tanto, todas las bacterias de una colonia son genéticamente iguales y constituyen un clon. Uno de los métodos más utilizados es el de agotamiento por estrías en placas de Petri o en tubos mediante el llamado pico de flauta o agar inclinado. De esta forma, en un recipiente de poco diámetro gran altura, como un tubo de ensayo, se logra exponer una gran superficie, favoreciendo la reproducción de bacterias aerobias.
 
Imagen 1: Placa de Petri y tubos con agar en pico de flauta
Según como se realiza el agotamiento tenemos dos formas distintas, una de ellas es por estrías rectas y la otra por zigzag.
Parte 4: Recuento bacteriano
En bacterias, la síntesis regulada de todos los constituyentes de una célula bacteriana produce primero un aumento de su masa y luego, cuando ésta ha sido duplicada, la división de la bacteria por el mecanismo de fisión binaria. De esta manera se originan dos bacterias hijas de las que puede decirse que, en términos generales, son iguales entre sí e iguales a la bacteria parental que les dio origen. A continuación cada una de las bacterias hijas repetirá el ciclo de la bacteria parental y se originarán 4 bacterias, aumentando el número de ellas, es decir de la población bacteriana, en progresión geométrica.
En medios líquidos el aumento del número de bacterias se visualiza como turbidez y/o formación de sedimento o película en los cultivos. En cambio, en medios agarizados el aumento del número de bacterias produce colonias macroscópicamente visibles, algunas de cuyas características (tamaño, forma, color, etc.) pueden contribuir a la identificación del microorganismo.
Para medir el crecimiento se pueden emplear técnicas que estimen el número de bacterias, ya sea totales o viables, o la masa celular. De acuerdo a la técnica empleada para el recuento, su resultado expresará el número de microorganismos totales (viables más no viables) o solamente viables presentes en una muestra, siendo éstos últimos los que poseen la capacidad de crecer y multiplicarse.
El recuento de microorganismos viables en placa se basa en la formación de una colonia a partir de cada célula viable, utilizando como soporte, medios agarizados en placas de Petri. No puede asegurarse indubitablemente que toda colonia derive de un solo microorganismo, por eso la forma correcta de expresar los resultados es como unidades formadoras de colonias (UFC).
El recuento se puede realizar por plaqueo en medios agarizados o por retención en una membrana filtrante. Las técnicas de recuento de viables en placas son sensibles, relativamente sencillas y se usan ampliamente para el recuento de bacterias y otros microorganismos en muestras de alimentos, medicamentos, agua, etc.
La forma corriente de realizar un recuento de unidades formadoras de colonias es la realizando diluciones seriadas 1/10 de una suspensión bacteriana o de una muestra en ensayo y sembrar volúmenes medidos de varias de ellas, de modo de obtener colonias separadas. Esto se logra cuando el número de colonias por placa de Petri es entre 30 y 300, dependiendo del tamaño de las colonias originadas. En general, por encima de ese límite hay superposición de colonias y por debajo de él la significación estadística es muy pobre. Las siembras se pueden hacer:
Por diseminación: sobre la superficie del medio ya gelificado y secado, contenido en la placa, de volúmenes de 0,1 – 0,2 ml de las diluciones correspondientes.
En profundidad: incorporando el inóculo en un volumen de medio fundido, mantenido a temperaturas compatibles con la viabilidad microbiana (aproximadamente 45°C), que luego se vuelca en una placa de Petri y se deja gelificar. Los volúmenes inoculados pueden ser de hasta el 10% del volumen del medio.
Luego de la incubación en las condiciones apropiadas para cada microorganismo, la concentración de UFCs presentes en una suspensión se calcula multiplicando el número de colonias por placa, promedio de varias placas, por la inversa de la dilución de la suspensión, y dividiendo por el volumen sembrado:
Imagen 2: Método de conteo en placa de Petri
Número más probable (NMP)
La concentración de microorganismos viables puede ser estimada por el método del número más probable (NMP). Este método infiere matemáticamente el recuento de viables a partir de la fracción de cultivos en tubos que no muestran crecimiento. Consiste en realizar varias diluciones de la muestra, inocular varias réplicas de las mismas en tubos conteniendo un medio de cultivo apropiado y registrar el número de tubos con crecimiento en cada dilución.
Es un método estadísticamente ineficiente, por lo que es necesario sembrar varios tubos con cada dilución.
Sin embargo, resulta útil para el recuento de microorganismos en suspensiones con baja concentración o que producen algún producto detectable en el medio, que permita diferenciarlo de otros microorganismos presentes en la muestra., por ejemplo para el recuento de coliformes en aguas, como la Escherichia Coli.
Imagen 3: Conteo de NMP con campanas de Durham en tubos
Luego de realizar el crecimiento bacteriano se cuentan la cantidad de tubos que dieron positivo y se mira en tablas el NMP
Tabla 1: NMP para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con porciones de 0.1; 0.01 y 0.001g.
Para expresar el resultado se utiliza la fórmula:
Parte 5: Identificación taxonómica y tinciones.
Identificación Taxonómica
Transcurrido el tiempo necesario para permitir el crecimiento de las colonias bacterianas en el medio de cultivo se procede a realizar distintas mediciones y determinaciones, como el recuento bacteriano, y una descripción en de la forma y aspecto de la colonia. De esto se ocupa la taxonomía. A partir de la forma de colonia, medio de cultivo seleccionado y otros estudios, como las tinciones, nos permite identificar las distintas especies. Para el análisis taxonómico se describen ciertas características importantes como:
Desarrollo: perceptible o no, luego de 24hs – 48hs
Tamaño: desde fracciones de mm hasta algunos mm
Cantidad: escasa, moderada o abundante
Cromogénesis: se describe si tienen color o no,
Caracteres ópticos: se observa si la colonia es transparente, traslucidas u opacas
Consistencia: Se comprueba con el ansa, puede ser butirosa, viscosa, fibrosa, seca o quebradiza
Morfología: una de los estudios más importantes es la forma de la colonia. En la misma se estudia la forma, la elevación y el borde. Según la forma las bacterias se clasifican en:
Cocos: células más o menos esféricas
Bacilos: en forma de bastón, alargados
Espirilos: al igual que los bacilos, tienen un eje más largo que el otro, pero dicho eje no es recto, si no que sigue una forma de espiral, con una o más vueltas de hélice.
Vibrios: proyectada su imagen sobre el plano tienen forma de coma, pero en el espacio suelen corresponder a una forma de espiral, con menos de una vuelta de hélice.
Imagen 4: Forma de las colonias según su estudio taxonómico
Imagen 5: Clasificación de bacterias según su estudio taxonómico
Para observar las bacterias teñidas es necesario, en primer lugar, hacer un frotis de las bacterias y fijarlo.
Para hacer un frotis, cuando se parte de un cultivo de bacterias en medio líquido, se toma una o varias cargas directamente con el ansa y se extienden sobre el portaobjetos. Si se parte de un cultivo en medio sólido, debe depositarse previamente una gota de agua sobre el portaobjetos. A continuación, se toma con el ansa una pequeña parte de la colonia y se dispersa en la gota de agua.
La fijación tiene por objeto provocar modificaciones en la composición físico-química de la bacteria (coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta conserve definitivamente una estructura similar a la que tenía en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida durante la tinción. Por otra parte la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes.
Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o el calor. Nosotros emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba, para no quemarla. Hay que procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alterarían las estructuras de la bacteria: en ningún momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano, debe quemar.
La tinción simple es la tinción en que se utiliza un solo colorante. Como colorantes se utilizan el azul de metileno o la safranina, ambos de naturaleza básica. Esta técnica permite observar la morfología y tamaño de las bacterias, así como los tipos de agrupaciones que forman.
La tinción de Gram es la tinción diferencial más utilizada en Bacteriología pues permite separar las bacterias en dos grandes grupos, las Gram-positivas y las Gram-negativas. La tinción de Gram requiere cuatro soluciones:
Primer colorante. Es un colorante básico que en contacto con las células cargadas negativamente, reacciona con ellas coloreándolas. El más utilizado es el cristal violeta.
Solución mordiente. Fija las tinciones y aumenta la afinidad entre el colorante y las células. Los mordientes empleados suelen ser sales metálicas, ácidos o bases, como, por ejemplo, una solución diluida de yodo – yoduro, llamada lugol.
Agente decolorante. Es un disolvente orgánico, por ejemplo, etanol-acetona (1:1) o etanol únicamente.
Colorante de contraste. Es un colorante básico de distinto color que el primer colorante, como, por ejemplo, la safranina o la fucsina. Los dos grupos bacterianos a los que anteriormente nos referíamos difieren en el color con el que finalmente aparecen. Las bacterias Gram positivas se teñirán de azul por el cristal violeta y no perderán esta coloración durante los pasos sucesivos. Las bacterias Gram negativas perderán la coloración inicial del cristal violeta en los siguientes pasos y se teñirán de rosa debido a la safranina. La diferencia está determinada por la composición de su envoltura celular. Las bacterias gram positivas poseen una malla de peptidoglicano en su parte más externa, mientras que las bacterias gram negativas, las recubre una fina capa de peptidoglicano, presentan una membrana externa que envuelve toda la célula.
Las bacterias Gram-positivas presentarán una coloración violeta mientras que las Gram-negativas la presentarán roja o rosa. La identificación de las bacterias Gram-positivas puede ser problemática, solamente cuando las bacterias Gram-positivas se encuentran en crecimiento exponencial (cultivos jóvenes) la reacción es clara; en fase estacionaria (cultivos viejos) las bacterias Gram-positivas pueden parecer Gram-negativas.
Parte 6: Microscopio Óptico.
El microscopio óptico costa de tres partes esencialmente:
Parte mecánica integrada por el pie, el brazo, el tubo, el revólver, la platina y los tornillos macrométricos y micrométricos
Parte óptica integrada por el ocular, el objetivo, el condensador y el diafragma
Fuente de iluminación que puede estar incorporada al microscopio o ser una fuente externa.
Un esquema típico de microscopio óptico es el siguiente
Imagen 6: Microscopio óptico
Las partes de un microscopio óptico son:
Objetivos: Son los grupos de lentes principales, es decir, los que determinan realmente el aumento máximo y el poder de resolución del microscopio. Cada objetivo lleva una inscripción formada por dos números separados por una barra. El primero, más grande, indica el número de aumentos del objetivo. El segundo se denomina apertura numérica y es una medida de la luminosidad del objetivo. Cuanto menor es la apertura numérica de un objetivo, mayor es la cantidad de luz que atraviesa el objetivo. Los objetivos de mayor aumento (40x y 100x habitualmente) tienen el extremo retráctil para protegerlos es caso de choque contra la preparación, ya que para enfocarlos hay que acercarlos mucho a la misma. Los objetivos de gran aumento sólo pueden ser utilizados si se interpone entre el objetivo y la preparación una gota de un líquido que tenga el mismo índice de refracción que el vidrio (generalmente aceite de cedro) por lo que se denominan objetivos de inmersión.
Ocular: Es el otro grupo de lentes del microscopio. Aumenta la imagen formada por el objetivo. En su parte superior lleva una inscripción que indica el aumento que produce.
Espejo: Sirve como fuente de luz al reflejar la de un foco externo. Tiene dos caras, una plana y otra cóncava para concentrar más la luz. En algunos microscopios es sustituido por una lámpara que se conecta a la red. PORTAFILTROS Soporte que admite filtros de vidrio de diversos colores. Estos filtros se utilizan para suavizar la luz o para aumentar el contraste.
Diafragma: Está formado por un conjunto de laminillas que dejan un orificio en su centro. El diámetro del orificio puede ser variado mediante una palanca, con lo que se regula la cantidad de luz que llega a la preparación. CONDENSADOR Es un sistema de lentes situado debajo de la platina que concentra la luz sobre la preparación, consiguiéndose así una iluminación más intensa.
Brazo: Sirve de soporte a los otros elementos del microscopio. Está articulado con el pie para poder inclinarlo y hacer así más cómoda la observación.
Pie: Soporte sobre el cual se apoya el microscopio.
Charnela Es el punto de articulación entre el brazo y el pie. Permite inclinar el microscopio para hacer más cómoda la observación.
Tubo: Es un tubo hueco que separa los dos grupos de lentes (ocular y objetivo).
Revólver: Permite colocar en posición de trabajo a los distintos objetivos con que cuenta el microscopio. Presenta unas ranuras que facilitan la fijación del objetivo en la posición correcta.
Tornillo macrométrico: Acerca o aleja rápidamente el objetivo a la preparación para hacer un enfoque aproximado. Se usa sólo con los objetivos de menor aumento.
Tornillo micrométrico: Permite enfocar con precisión, moviendo muy lentamente el objetivo.
Platina: Es la superficie sobre la cual se colocan las preparaciones. Tiene un orificio en su centro para permitir el paso de la luz. En algunos microscopios está dotada de un sistema con dos tornillos que permiten el desplazamiento preciso de la preparación.
Pinzas: Sirven de sujeción de la preparación sobre la platina.
Tornillos del condensador: Permite subir o bajar el condensador respecto a la platina para mejorar la iluminación.
Llamamos preparado definitivo a una muestra, en general muy delgada de material, convenientemente tratada y coloreada, que se apoya en un rectángulo de vidrio llamado portaobjetos. Sobre la muestra se coloca una lámina de vidrio de muy poco espesor, el cubreobjetos, el cual se adhiere mediante cementos adecuados. Dependiendo del tipo de material a observar puede haber modificaciones en la técnica empleada y en el aspecto final del preparado
Imagen 7: Portaobjetos y cubreobjetos
Para el uso correcto del microscopio hay ciertos cuidados que hay que tener en cuenta a la hora de utilizarlo
Coloca la preparación de tal manera que el objeto de observación quede situado en el centro del orificio de la platina y, por supuesto, con el cubreobjetos hacia arriba. Asegúrate de que está puesto el objetivo de menor aumento y que éste está suficientemente alejado de la platina.
Mirando lateralmente el microscopio acerca el objetivo de menor aumento (el más corto) a la preparación para después, mirando a través del ocular, enfocar (con el tronillo macrométrico) alejándolo.
Moviendo muy lentamente la preparación centra la zona más interesante en el campo de visión. Si no lo haces así, al cambiar a un aumento mayor puede que no consigas ver nada ya que cuanto mayor es el aumento, menor es el campo de visión.
Pasa al objetivo siguiente girando el revólver y corrige ligeramente el enfoque con el tornillo micrométrico. En todo momento tienes que asegurarte de que al girar el revólver has anclado el objetivo perfectamente en su posición (existe un pequeño tope que te lo indica).
Dibuja los objetos observados. El dibujo debe ser fiel a lo que observamos pero podemos suprimir detalles innecesarios para simplificarlo (por ejemplo, si hay muchas células semejantes en el campo de visión, no es necesario dibujarlas todas, sino que bastará si nos fijamos en algunas y las dibujamos con precisión). Junto a estos dibujos debe ir una indicación de los aumentos con que se ha realizado la observación. Para saber el aumento total que estamos empleando se multiplica el aumento del ocular por el aumento del objetivo que estemos utilizando.
Vuelve a poner el objetivo de menor aumento, levanta el tubo y retira la preparación.
Cubre el microscopio con su funda de plástico.
Para enfocar con la lente de inmersión (x100) se usa un medio de inmersión para la lente; de este modo; los rayos luminosos no se debían al pasar desde el objeto al objetivo, y se obtienen así una mayor cantidad de rayos con información del objeto. Por lo general se usan medios cuyo índice de refracción sea semejante al del vidrio, por ejemplo: aceite de cedro, vaselina líquida, etc. El medio de inmersión debe ser colocado sobre el preparado en poca cantidad (una gota alcanza). Para iniciar el procedimiento de enfoque el objetivo debe estar sumergido en el medio. Hay que extremar los cuidados, porque la distancia de trabajo es mínima y el riesgo de pasar a través del preparado es máxima.
Normas básicas para el cuidado del microscopio
Al ser el microscopio un aparato de precisión y, por lo tanto, delicado, es muy conveniente asegurar un buen funcionamiento atendiendo siempre a las siguientes normas:
Para transportar el microscopio deben utilizarse siempre las dos manos, sujetándolo por el brazo con una mano y por el pie con la palma de la otra.
Una vez colocado el microscopio en su sitio, no debe moverse hasta que finalice la práctica. Cuando se vaya a cambiar de observador se debe mover él y no el microscopio.
Mover siempre suave y lentamente cualquier elemento del microscopio.
Nunca poner los dedos en las lentes del ocular ni del objetivo. Si se ensucian dichas lentes se limpiarán con un paño suave de algodón, sin utilizar ningún disolvente.
No sacar de su sitio el ocular ni los objetivos, a no ser que vayan a ser sustituidos, en cuyo caso la operación debe realizarse lo más rápidamente posible, para evitar la entrada de polvo.
Asegurarse de que el portaobjetos está bien seco cuando va a ser colocado sobre la platina.
Al enfocar, sobre todo con los objetivos de mayor aumento, hay que evitar que el extremo del objetivo choque con la preparación. Para ello acercaremos el objetivo a la preparación mirando lateralmente y luego, mirando ya a través del ocular, enfocamos alejando el objetivo.
Esterilización por calor seco
La esterilización se hará en estufa. Se debe evitar la colocación del material apretujado y la carga excesiva ya que de este modo se obstaculiza la libre circulación del aire caliente, produciéndose diferencia de temperatura en esos ligares. Este método es el que más se utiliza para esterilizar material de vidrio, que deberá estar seco, para evitar peligro de rotura. Previo a introducir el material en la estufa las pipetas y placas de Petri deben envolverse en papel de diario. La carga de la estufa se realiza cuando está fría, como así también la descarga, para evitar cambios bruscos de temperatura frente al material, evitando roturas por shock térmico. La duración del proceso de esterilización es de 1hs-2hs contándose desde que la temperatura alcanza los 170°C.
Esterilización por calor húmedo
En este caso, por calor húmedo se esterilizarán tubos de ensayo con caldo Mc Conkey, erlenmeyers con caldo de carne y erlenmeyers con agar nutritivo y tubos de ensayo con cotonetes. Para realizar esto se utilizará el autoclave Chamberland
Abrir la tapa del aparato y verter agua en el interior hasta que alcance el nivel de la placa cribada.
Colocar el material a esterilizar previamente con tapones de algodón, envueltos en papel de diario y atados con gomitas elásticas
Cerrar la tapa del autoclave y los tornillos se los ajusta en posición cruzada y no correlativa para no descentrar la tapa.
Encender la calefacción.
Abrir la espita para purgar el equipo y se cierra cuando empieza a salir vapor.
Se asegura el buen funcionamiento del equipo levantando y haciendo girar la espita 2 o 3 veces.
Luego de aproximadamente 10 minutos del encendido, comenzará a salir vapor por la espita, entonces se espera 5 minutos y se cierra. Aguardar hasta que el manómetro marque 1atm y a partir de ese momento contar 15 o 20 minutos.
Una vez que pasó el tiempo estipulado se apaga la calefacción y se abre la espita para desalojar el vapor del aparato
Cuando el manómetro marca 0, abrir la tapa y estraer el material esterilizado.
Tener en cuenta que si el vapor silba y el manómetro marca 0, o que el vapor saliera por el manómetro o por cualquier otra conexión, suspender la operación.
Parte 2: Medios de Cultivo para crecimiento de microrganismos
Pesar 1g de alimento en un vaso de precipitados pequeño y agregar 10ml de agua.
Pesar 1g de alimento en un vaso de precipitados pequeño y agregar 10ml de caldo de carne estéril. Colocar en tubo de ensayo estéril y reservar para la práctica de tinción.
Con los cotonetes esterilizados frotarse las paredes interiores de la boca.
Recorrer el colegio y tomar distintas muestras con los cotonetes esterilizados.
Para tomar muestras de agua de la red primero flamear la salida de agua de la canilla con un encendedor, abrir la canilla y dejar circular el agua unos instantes, abrir el erlenmeyer esterilizado tomando el tapón de algodón con el meñique, llenar hasta la mitad de su capacidad con agua y cerrar el erlenmeyer de nuevo.
Parte 3: Métodos para aislamiento de cultivos bacterianos puros
Método general: En todos los prácticos que se realicen en condiciones de esterilidad se debe, en primer lugar, limpiar el área de trabajo de la mesada con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero. Los métodos de sembrado son:
Aislamiento en profundidad (en placa por volcado): Fundir el medio contenido en un tubo y luego enfriarlo hasta que se lo pueda tomar con la mano sin quemarse (A). Flamear el ansa (B). Transferir microorganismos al medio con el ansa (C y D). Agitar rotando el tubo entre las manos para que se homogenice bien (E). Volcar en una placa de Petri estéril (F). Agitar con un movimiento rotatorio hasta asegurar una buena distribución (G). Incubar boca abajo (H). Un método alternativo muy usado es volcar en la placa vacía una suspensión bacteriana y luego con el medio fundido y enfriado según (A) volcarlo y efectuar los pasos (G) y (H).
Imagen 8: Placa por volcado
Método de agotamiento (estriado en placas): Flamear el ansa en posición vertical (A). Obtener un inóculo con ella (en forma estéril) (B). Estriar con el ansa en medio estéril contenido en una placa de Petri siguiendo uno de los modelos mostrados en (C) y (D).
Imagen 9: Estriado en placa de Petri
Siembra en agar inclinado (pico de flauta) por estría: Flamear el ansa en posición vertical (A). Obtener material a sembrar (B). Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar con el diseño mostrado en (C y D)
Imagen 10: Estriado en pico de flauta
Inoculación por punción: Este método se utiliza para verificar la presencia de bacterias aerobias (crecen sobre la superficie del agar), facultativas (crecen sobre la estría de punción a lo largo del tubo) o anaerobias (crecen en la parte inferior del tubo). Para ello, flamear un ansa recta (A). Sumergirla una vez fría, en una suspensión bacteriana (B). Punzar cuidadosamente en el centro del tubo hasta el fondo y retirar el ansa cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino que para la inoculación (C). Flamear el ansa en posición vertical (D). Incubar el tubo (E).
Imagen 11: Inoculación por punción
Con las muestras realizadas anteriormente en la siembra, realizar los cuatro métodos de crecimiento bacteriano colocando en las placas para vertido 30ml de agar nutritivo y 1ml de agua a analizar. En el caso de las muestras tomadas con los cotonetes, raspar suavemente la superficie de las placas con 30ml agar nutritivo y sobre los picos de flauta.
Análisis de Escherichia Coli en agua de red (opcional): A una serie de tres tubos grandes con 10ml de caldo Mc Conkey con campanita de Durham colocar 10ml de agua de muestra en cada uno. A una serie de 3 tubos chicos con 5ml de caldo Mc Conkey se siembran 2 tubos con 0,5ml de y 1 tubo con 1ml de agua de muestra. Una caja de Petri con medio nutriente de agar tripticasa de soja sobre 1ml de muestra, Se rotulan las cajas y las gradillas con los tubos. Se realiza la siembra en cada serie con una popeta por muestra. Se deja 48hs en estufa a 37°C. Si ha aparecido viraje de la placa de Petri a color amarillo, se ha producido gas en las campanitas de Durham y hay turbidez en los tubos entonces hay bacterias de la cepa Escherichia Coli en el agua. Si sólo hay turbidez en los tubos, el agua se encuentra contaminada con microrganismos mesófilos
Parte 4: Recuento bacteriano
Nota: No se realizará en el laboratorio
Parte 5: Identificación taxonómica y tinciones.
Hacer el frotis, secarlo y fijarlo. Cubrir con azul de metileno la preparación y dejarlo actuar durante un minuto. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x) empleando el aceite apropiado o vaselina líquida. Realizar el análisis taxonómico.
Tinción Diferencial de Gram
Se prepara el frotis, se seca y se fija. Se cubre con cristal violeta durante un minuto. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante. Se traza con lugol un minuto. El lugol actúa como mordiente aumentando la afinidad del colorante por la bacteria. Lavar con agua el exceso de lugol. Se gotea alcohol-acetona de forma continua hasta que la preparación deje de perder color y se lava enseguida con agua abundante. Se cubre la preparación con un colorante de contraste, como la safranina o fucsina, y se lo deja actuar durante un minuto. Se lava con agua y se seca al aire, observándose a continuación con el objetivo de inmersión. Una coloración violeta indica la presencia de bacterias Gram positivas y una coloración rasada a roja indica la presencia de bacterias Gram negativas.
Coloración de esporas (opcional)
Esta técnica permite distinguir las esporas, del cuerpo vegetativo del microorganismo, como así también ver su localización y forma. Prepare un extendido del microorganismo. Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solución de verde de Malaquita. Calentar hasta emisión de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.) Lavar con agua y cubrir con solución de safranina. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersión. Informar: morfología, color y tipo de espora. La solución de verde de Malaquita se prepara al 5 % en agua destilada y la solución de safranina, 0.5 g en 100ml agua destilada.
Tinción negativa (opcional)
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas. Para ello, Colocar una pequeña gota de tinta china en la parte central del portaobjetos. Utilizando el ansa, colocar una gota de la suspensión de microorganismos sobre la tinta china. Colocar sobre el preparado un cubreobjeto para que se forme un film (tinta-cultivo). Observar con objetivo de inmersión.
Trabajo Práctico n°2: Biomoléculas
Objetivos: Realizar reacciones típicas de caracterización de biomoléculas y extraer el ADN de células eucariotas de frutas.
Clasificación de los glúcidos
Según la cantidad de unidades que conformen la unidad estructural los glúcidos se clasifican en:
Monosacáridos: Son los más sencillos. Los más importantes son la glucosa o dextrosa (azúcar de uva) y la fructosa (azúcar de caña o de remolacha).
Disacáridos: Son la unión de dos monosacáridos. El azúcar común es un disacárido (sacarosa) que se obtiene de la glucosa y de la fructosa. Otros importantes son la lactosa o azúcar de leche (glucosa y galactosa) y la maltosa (se encuentra en la cerveza).
Polisacáridos: Compuestos por la unión de varios monosacáridos (a veces más de mil). Destacan la celulosa y el almidón en las plantas y el glucógeno que es el polisacárido de reserva propio de los tejidos animales
Heterósidos : son sustancias que están compuestas por glúcidos y otras sustancias
Los monosacáridos son azúcares simples que contienen de tres a seis átomos de carbono. Son polialcoholes con función aldehído o cetona. Los carbohidratos más simples contienen en consecuencia tres átomos de carbono (triosas): el gliceraldehído, que posee una función aldehído y dos funciones alcohólicas y la dihidroxiacetona, con una función cetona y dos funciones alcohólicas. La ribosa es una pentosa común (aldopentosa) que es componente de los ácidos ribonucleicos (ARN); su derivado desoxigenado, la desoxirribosa (que carece de hidroxilo alcohólico en C2) es integrante de los ácidos desoxirribonucleicos (ADN). La glucosa, galactosa y manosa son aldohexosas, en tanto que la fructosa es una cetohexosa.
Se denominan L o D según a la configuración absoluta de los grupos ligados al tetraedro del átomo de carbono. El compuesto de tres carbonos denominado gliceraldehído sirve de base para la denominación de todos los enantiómeros. El isómero D de cada compuesto es aquel cuyo último carbono asimétrico tiene el grupo hidroxilo ubicado a la derecha y la L a aquellos cuyo último carbono asimétrico tiene el grupo hidroxilo ubicado a la izquierda. Los compuestos que desvían el plano de luz polarizada hacia la derecha se llaman dextrógiros o dextrorrotatorios, y esa característica se indica anteponiendo el signo (+) al nombre del compuesto. Los compuestos que desvían el plano de luz polarizada hacia la izquierda se llaman levógiros o levorrotatorios, y esa característica se indica anteponiendo el signo (-) al nombre del compuesto. En las células sólo se produce uno de los dos enantiómeros de un compuesto. Por ejemplo, la mayor parte de los azúcares son isómeros D. Aunque tienen propiedades químicas similares y propiedades físicas idénticas (excepto en cuanto a la dirección en la cual rotan la luz polarizada en un plano), las células distinguen entre dos isómeros: sólo uno de ellos es biológicamente activo.
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