El método de siembra por estría en placa




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fecha de publicación18.02.2016
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

NOMBRE: Estefanía Fienco

CURSO:

REACTIVACION DE CEPAS

El procedimiento se fundamenta en la reactivación de los cultivos de referencia certificados (liofilizados o congelados), a través de la utilización de medios de cultivo específicos, incubando a la temperatura y tiempo establecido para cada microorganismo.

PROCEDIMIENTO DE Reactivación del cultivo de referencia:

  1. Reactivar los cultivos de referencia certificados (liofilizados o congelados), siguiendo las instrucciones indicadas por el proveedor.

  2. Preparar subcultivos en fase estacionaria, en tubos de agar tripticasa soya e incube a la temperatura y tiempo adecuado.

  3. Subcultivar en medio sólido y líquidos selectivos y no selectivos.

  4. Registrar las características morfológicas y fisiológicas (utilice métodos convencionales y/o rápidos para la identificación de microorganismos).

  5. Elaborar cultivos de reserva a partir del cultivo obtenido en el punto 2 y preservar. Se deben rotular con el nombre del microorganismo, número de identificación (ATCC) y fecha. Mantener los registros del número de cultivos de reserva preparados por lote.

  6. Elaborar los cultivos de trabajo subcultivando uno de los cultivos de reserva. Identificar con el nombre del microorganismo y el número de lote.

  7. Registrar la información.

TECNICAS DE AISLAMIENTO



  • El método de siembra por estría en placa

Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias visibles

  • Los métodos de vertido en placa y extensión en placa

En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyenantes de su siembra en placa. Se siguen estas técnicas cuando la muestra contiene tantos microorganismos, que la dilución no se puede realizar en una sola etapa. Por ejemplo, una suspensión con mil millones de células por mililitro debe ser diluida 107 veces para obtener una suspensión con un centenar de células por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien. Para realizar diluciones de diez en diez, se añade 1 ml de la suspensión bacteriana a 9 ml (le medio estéril o solución salina, igualmente estéril. Se agita vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite cuantas veces sea necesario. A continuación, se puede proceder de dos maneras diferentes.

En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes. En el segundo método (extensión en placa), las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendiéndolas con avuda de un asa de Diralsky de cristal estéril. La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra por estría, por tanto se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de microorganismos.

SELECCIÓN Y PROPAGACIÓN

  • Medios definidos

Un medio definido es aquel del cual conocemos su composición química exacta, porque ha sido preparado a partir de compuestos químicos puros.

Los medios definidos se usan generalmente para realizar estudios genéticos, pero sus inconvenientes a menudo sobrepasan sus ventajas. Así, se requiere un tiempo considerable para preparar un medio definido y las bacterias crecen más despacio en ellos. Además, no conocemos los requerimientos nutricionales de todas las bacterias y, por tanto, no siempre pueden utilizarse.

  • Medios complejos

Se desconoce la composición química exacta de un medio complejo. Estos medios se preparan a partir de extractos de productos naturales tales como carne, sangre, caseína (la proteína de la leche), levaduras o soja.

Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja.

  • Medios diferenciales

Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo.

  • Medios selectivos-diferenciales

Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella yShigella, bacterias entéricas (del intestino) que causan disenterías.

  • Medios de enriquecimiento

Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una población mixta de gran tamaño.

PRESERVACION

LIOFILIZACIÓN:

Es un proceso de desecación desde el estado congelado

  • Agente crioprotectores:

  • leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V

  • pueden adicionarse Aditivos como inositol


CONGELACION A BAJAS TEMPERATURAS:

  • Agentes crioprotectores:

  • leche descremada de calidad microbiológica (esterilización por vapor fluente) al 10% o 20% P/V

  • Puden adicionarse Aditivos como inositol

  • Glicerol al 10%

  • Caldo BHI con glicerol al 20%

Las temperaturas de congelación deseables es de -70 o -80°C o menores temperaturas. A temperaturas más altas como -20°C no es ideal pero tal vez sea la única forma posible. Es preferible a -40°C.

ENVASE: Uso de criovial o tubo estéril.

VIABILIDAD

Se evalúa mediante la enumeración (cuenta indirecta) de las colonias que aparecen sobre el medio, después de sembrar una serie de diluciones sucesivas de la suspensión original e incubándolas, durante el tiempo necesario. El porcentaje de viabilidad, se determina mediante la relación del número de bacterias viables determinadas al tiempo del muestreo, con respecto a aquellas determinadas al inicio del período de conservación.

PRUEBAS BIOQUIMICAS Y DETERMINACION DEL GENERO Y ESPECIE DE LA CEPA

Identificación de una cepa bacteriana desde el punto de vista bioquímico:

 1) Obtener un cultivo puro

 2) Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración Gram. Se determina así la forma y el Gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de esporas y otras características morfológicas de interés.

 3) Determinar las características nutricionales (en general se desprenden de los métodos empleados en el aislamiento y cultivo anteriores); fotoautótrofos, fotoheterótrofos, quimioautótrofos, quimioheterótrofos.

 4) Realización de pruebas primarias:  En la siguiente tabla, modificada del Cowan & Steel's Manual of Identification of medical bacteria, se utilizan un grupo de pruebas, denominadas pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son:  Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, fermentación de glucosa, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosisy movilidad.

 TABLA MODIFICADA DE COWAN´S & STEEL PARA IDENTIFICACION DE BATERIAS HETERÓTROFAS

 

tinción gram
(cultivo fresco)

+

+

+

+

+

+

+

+











forma

coco

coco

coco

coco

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

bastón

coco

agrupación

racimos

racimos

cadenas

tetradas

 

 

 

 

 

 

 

 

pares

crecimiento 
aerobio

+

+

+

+

+



+

+

+

+

+

+

+

crecimiento 
anaerobio



+

+

+

+

+

+







+

+



esporas











+

+

+











movilidad 











+ o –

+ o –

+ o –

+ o –

+ o  –

+ o -

+



catalase 

+

+









+

+

+

+

+

+

+

oxidase 

 

 

 

 

 

 

 

 

+

+



+

+

fermentación de
glucosa a acido 
o a acido+gas



+

+

+

+

+ (o –)

+







+

+



O/F 

 

 

 

 

 

 

 

 



O

F

F

O

Micrococcus

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Staphylococcus

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Streptococcus

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lactococcus

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Enterococcus

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Leuconostoc

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Pediococcus

 

 

X

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Aerococcus

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lactobacillus

 

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

 

Clostridium

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 

 

 

 

Bacillus

 

 

 

 

 

 

X

X

 

 

 

 

 

Alcaligenes

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 

Pseudomonas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

 

 

 Enterobacterias

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

 

Aeromonas

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

Chromobacterium

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X

 

Neisseria

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

X


 5) Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia determinado. (ej: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de fenilalanina deaminasa, etc.)
BIBLIOGRAFÍA:

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