Subdirección de Enseñanza e Investigación




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CENTRO MEDICO NACIONAL 20 DE NOVIEMBRE

Subdirección de Enseñanza e Investigación

Coordinación de Investigación
No. de Registro ________

PROTOCOLO




Unidad Médica:

Centro Médico Nacional “20 de Noviembre”

Coordinación de Investigación

Teléfono/ext.

52 00 50 03 ext. 14609

Título:

EVALUACIÓN DE LAS MUTACIONES G2019S y G2385R DEL GEN NUECLEAR LRRK2 Y POLIMORFISMO DE NUCLEOTIDO ÚNICO (SNP) EN EL GEN ND3 Y H A10398G y T4336C DEL ADN MITOCONDRIAL EN MESTIZOS MEXICANOS CON ENFERMEDAD DE PARKINSON ESPORÁDICA (EPE)






NOMBRES

FIRMAS

Investigador responsable:

Silvia García




TUTOR

Investigadores asociados:

Ramon M. Coral





Carlos Galaviz




Luis Dávila Maldonado




Carlos Cuevas García




Juan Carlos Falcón




Erika Meza Dávalos




Sergio Sauri Suárez




Lucino Castillo




Bertin Martínez Silva




Manuel Hernández




Luz Berenice López Hernández







Liana Patricia Canto






Para presentar en:

CONACYT

Para publicación en:

Revista Especializada en el tema



Para ser llenado por la Jefatura de Investigación

Fecha de recepción:




Fecha de aprobación:




Fecha de terminación:




Fecha de informes parciales:

Informes trimestrales, semestrales y anual

Evaluación de informes:

% de avance por etapa


  1. Problema.-

Pregunta específica que dio origen a este estudio

La enfermedad de Parkinson esporádica (EPE) es una enfermedad neurodegenerativa que ocupa el segundo lugar en frecuencia en el mundo occidental la cual causa gran incapacidad funcional y la erogación de grandes sumas a los diferentes sistemas de salud. Se desconoce su etiología y hasta el momento no existe ningún tratamiento que modifique la historia natural de la Enfermedad, la cual evoluciona a la incapacidad funcional, postración, en 30% demenciación y la muerte en término de 10-15 años a partir del diagnóstico. Existe evidencia de que los primeros síntomas de la enfermedad aparecen cuando la depleción de neuronas dopaminérgica alcanzó el 70%, y a través de estudios neuroifuncionales se ha llegado a determinar que el periodo entre el inicio de la perdida de células neuronales hasta una despoblación del 70% es de alrededor de cinco años, tiempo en que podríamos, sí encontramos marcadores moleculares, actuar de manera profiláctica.

¿Las mutaciones G2019S y G2385A del gen LRRK2 y los Polimorfismos de Nucléotido (SNP) A10398G, Y T4336C del ADN mitocondrial modifican el riesgo de padecer Enfermedad de Parkinson no familiar en mestizos mexicanos?

2. Hipótesis

La hipótesis de trabajo plasma el concepto que el investigador tiene del problema y la solución del mismo. Es una suposición comprobable, basada en ciertos indicios y que se formula afirmando o negando algo de lo que se tiene certeza; debe ser clara y precisa.

Las mutaciones G2019S y G2385A del gen LRRK2 y los Polimorfismos de Nucléotido (SNP) A10398G y T4336C del ADN mitocondrial modifican el riesgo de padecer Enfermedad de Parkinson no familiar en mestizos mexicanos

3.- Antecedentes

La Enfermedad de Parkinson Esporádica (EPE) es un padecimiento neurológico, degenerativo y progresivo que afecta primordialmente el movimiento y de etiología desconocida; es el segundo trastorno neurodegenerativo que motiva consulta neurológica.1 Pese a los múltiples estudios sobre su génesis y los avances en su tratamiento aún no ha sido posible modificar la progresión de la enfermedad. Se describió en 1817 por James Parkinson; se caracteriza por temblor de reposo, bradicinesia, rigidez y más tardíamente alteración de los reflejos posturales,2 en 30% de los casos demencia.3 Se calcula que afecta 1 millón de personas en USA, 0.3% en población general y 3% en individuos entre 65-90 años, solo 5 -10 % se inicia antes de los 40 años; su prevalencia varía entre 100-350 por 100,000 en la población general de raza blanca y aumenta a más de 600 por 100,000 en población mayor de 75 años;4 en Europa las cifras ascienden a 3600 en 100,000 en individuos mayores de 85 años.5 La expectativa de vida se reduce en la EPE ya que estos sujetos tienen un riesgo de dos a cinco veces más de morir en relación a sus controles.6 Histopatológicamente se caracteriza por la muerte selectiva de poblaciones heterogéneas de neuronas, principalmente dopaminergicas de la pars compacta de la sustancia nigra de cuya pérdida derivan la mayoría de las manifestaciones clínicas de la EPE las neuronas más afectadas se localizan en los complejos nucleares de las áreas A8, A9 y A10; otros grupos afectados son neuronas catecolaminéregicas y serotoninérgicas de núcleos ceruleus y del rafé respectivamente, neuronas colinérgicas del núcleo basal de Meynert, hipotálamicas, neuronas corticales particularmente del cíngulo y corteza entorrinal, células del bulbo olfativo, ganglios simpáticos y neuronas parasimpáticas del intestino.7 Las neuronas remanentes en el SNC presentan inclusiones intracitoplásmicas que se tiñen con anticuerpos contra ubiquitina y alfa-sinucleína denominados Cuerpos de Lewis evento cardinal en la patogénesis de la enfermedad. La participación de agentes externos para el desarrollo de la EPE fue manifiesto debido a la exposición a metil-fenil-tetrahidropiridina (MPTP), sustancia que daña selectivamente a las neuronas productoras de dopamina;8 esta situación se ve reforzada por la asociación existente entre varias enzimas relacionadas a especies reactivas de oxígeno a las cuales son muy vulnerables estas neuronas, ambas situaciones parecen ejercer una acción sinérgica en la muerte celular.9 No existe un marcador biológico para el diagnóstico in vivo de la enfermedad por lo que el cuadro clínico es fundamental para este propósito, así el inicio asimétrico de los síntomas y la adecuada respuesta a la levopodopa son dos elementos clave; sin embargo, en estadios tempranos el diagnóstico no es fácil, estudios retrospectivos que incluyeron centros neurológicos con expertos en EPE hubo correlación clínica e histopatológica (autopsia) del 75%,10 por tal razón, se han creado diversos criterios diagnósticos para la EPE, entre los más aceptados están los Criterios Clínicos del Banco de Cerebros de la Sociedad de Enfermedad de Parkinson del Reino Unido,11 cuya certeza diagnostica es cercana a 90%; los puntos que evalúan son: a) Síntomas esenciales para el diagnóstico del síndrome parkinsónico; b) criterios de exclusión para el diagnóstico de la EP; y c) criterios de apoyo del diagnóstico de la EP. Anexo 1. Koller et al.,12 diseñaron otra herramienta que establece que para el diagnóstico de EPE definitivo los siguiente criterios: a) Existencia por un año o más de los tres signos motores cardinales de la enfermedad: temblor de reposo o postural, rigidez y bradicinesia, y b) respuesta a la administración de levodopa, al menos en una dosis diaria de un gramo durante un mes y que produzca moderado o marcado grado de mejoría que perdure un año o más; y una lista larga de criterios de exclusión. Los Criterios para el diagnóstico de la enfermedad de Parkinson por el Advisory Council of the National Institute of Neurological Disorders and Stroke, US National Institutes of Health inclute: A. Signos motores cardinales: Temblor de reposo distal (3-7 Hz); Rigidez; Bradicinesia; Inicio asimétrico. B. Criterios de exclusión: Inestabilidad postural precoz; Fenómeno de “congelamiento”; Alucinaciones no relacionadas con la farmacoterapia; Demencia precoz; Parálisis de la mirada vertical; Disautonomía grave no relacionada con la farmacoterapia y Causas claras de parkinsonismo sintomático. Finalmente y debido a que ninguna manifestación clínica resulta suficientemente sensible y específica por sí misma Gelb et al.13 han propuesto varias combinaciones de los criterios clínicos mencionados e identificar diferentes niveles de diagnóstico: posible, probable y definitivo (anexo 2).

La EP en jóvenes es rara, suele ser familiar de trasmisión mendeliana autosómica dominante y autosómica recesiva;14 en pacientes con EP de inicio temprano se advirtió un patrón de trasmisión autosómica recesiva, Lücking et al.15 encontraron mutaciones en el gen de Parkina-1 en 49% de 73 familias con al menos un individuo afectado antes de los de 45 años. Otro de los genes que ha sido estudiado en familias afectadas es el de alfa-sinucleína, proteína presináptica que posiblemente participa en la plasticidad neuronal, se encuentra localizado 4q21l;16 la participación de esta proteína en la patogénesis de la enfermedad es de trascendencia, existen varías mutaciones demostradas en este gen: G209A; C88G de trasmisión autosómica dominante relacionada con una evolución clínica parecida a las formas esporádicas de la enfermedad; otra mutación se localiza G188A, es rara, se vincula a demencia; recientemente a 158 casos en 28 familias (de trasmisión autosómico dominante) con al menos un afectado, se les estudió polimorfismo conformacional de cadena única (SSCP), en una familia de ascendencia griega se observó, mutación en A53T, y en otras se demostró una penetrancia reducida de esta mutación.17 Al menos 16 alteraciones genéticas han sido documentadas en los pacientes con EP y aunque la mayor parte de ellas se asocian a una trasmisión mendeliana existen otras cuya trasmisión queda aún obscura.18 Valente et al. mapearon 1p36 (PARK6), encontraron que las mutaciones de PINK1 (PTEN-induced kinase 1) se asociaron a PARK6, identificaron en tres individuos consanguíneos dos mutaciones que afectan el dominio PINK1-cinasa. Los cultivos celulares sugieren que PINK1 se localiza en la mitocondria y podría ofrecer un efecto protector sobre la célula, dicho efecto se perdería a causa de un polimorfismo o una mutación y, en tales circunstancias sería susceptible el efecto deletéreo del estrés oxidativo.19 El gen de DJ-1 codifica ubiquitina proteína conservativa codificada por el mtDNA cuya función mas o menos conocida es el de “etiquetar” proteínas y escoltarlas hasta el proteosoma para ser degradadas en éste; también se ha asociado en la respuesta al estrés oxidativo; Bonifatu et al. encontraron que mutaciones de DJ-1 están asociada a PARK 7 en una forma monogénica de EP, lo que apoya que la falta de DJ1 coadyuva a la neurodegeneración.20 La mayor parte de los genes mencionados están relacionados con el desarrollo de formas de la EP familiares, sin embargo, al evaluarles en pacientes con la enfermedad esporádica (donde conforme se incrementa la edad de aparición de la EP hay menor número de individuos afectados en la familia), la frecuencia de mutaciones disminuye ostensiblemente. Teniendo en consideración que la mayoría de los casos de la EP son esporádicos, los diferentes investigadores se han dado a la tarea de buscar genes asociados con estas formas de la enfermedad. Posiblemente el gen más importante relacionado con la EPE sea la cinasa 2 rica en repetidos de leucina (LRRK2) también denominada dardarina, este gen fue descrito inicialmente en una familia japonesa y posteriormente en familias de la región vasca (de donde viene su nombre que significa temblor).21 La mutación G2019S en ese gen es un factor de peso como causa del Parkinson tanto familiar como esporádico en poblaciones de todo el mundo;22 es la primera mutación conocida que es común en razas diferentes. El gen (LRRK2) tiene 51 exones, codifica para una proteína de 2517 aminoácidos cuya función no se conoce; tiene 5 dominios funcionales que son un dominio rico en aa repetidos de leucina, un dominio ROC (ras guanosina trifosfatasa), un dominio C-terminal de ROC, un dominio WD40 (repetidos de g-transducida) y un dominio catalítico de tirosin cinasa. En un inicio se encontraron 6 mutaciones diferentes,23 actualmente se han detectado más de 41 mutaciones,Error: Reference source not found la séptima mutación la G2019S fue descrita por Gosal et al en el 2005,24 esta mutación parece ser más frecuente que cualquiera de las otras asociadas a la enfermedad. A la fecha, solo la mutación R1441S se observó en el 8% de los pacientes con la EP (tanto familiar como esporádico) del País Vasco.Error: Reference source not found Haugarvoll et al25 estudiaron la mutación de R1441C en EPE y la comparaon con La presenciad e mutación G2019S, la edad promedio de inicio de la enfermedad en su grupo de estudio fue de 60 años (30–79) menos del 20% iniciaron antes de los 50 años, en tanto que >90% de los mayores de 75 años desarrollaron síntomas de la enfermedad, no encontraron diferencias entre ambas mutaciones y la EPE; el análisis de haplotipo sugirió 4 tipos independientes para la mutación de R1441C. Una mutación recientemente identificada en población china es la G2385R.26 La mutación 6055 GA produce un cambio aminoacídico G2019S se encuentra localizada en el exón 41 en el dominio MAPKKK que se conoce está involucrado en la transducción de señales provocando un efecto sobreactivador a través de la hiperfosforilación de sustratos; sin embargo, Ishihara et al.27 en el 2006, evaluaron algunos pacientes con mutaciones en estado homocigoto y heterocigoto sin encontrar diferencias en su evolución clínica, aunque fue frecuente en pacientes con EPE. La mutación 7153G>A produce el cambio G2385R en el dominio funcional WD40 de la proteína LRRK 2 generando un cambio conformacional en el mismo, sus efectos funcionales no se conocen;Error: Reference source not found la evaluación de esta mutación, es a través de secuenciación automatizada el gen NURR1 (un factor de transcripción) el cual se expresa en las neuronas dopaminérgicas y en la substancia nigra.28 Un reporte en 2002 mostró un incremento de la frecuencia del polimorfismo en el intrón 6 del gen NURR1 (N16P) en pacientes con EPE y EPF comparados con controles (6.7% vs 0.9%) pero solo en homocigotos,29 la evaluación de esta mutación es a través de un RFLP. 30 El gen SNCAIP fue identificado en 2003 codifica la proteína sinfilina-1, la cual es el constituyente principal de los cuerpos de Lewys en los pacientes con EPE, 31 la expresión de este gen genera la silfilina-1 (con 919 aminoácidos) y la silfilina ambas producidas por el cerebro y localizadas en la terminales sinápticas., aunque ambas inteactúan con otras proteínas su función todavía no se conoce. La silfilina-1 en 2003 fue evaluada en 328 pacientes alemanes con enfermedad de EPF y EPE, se observó en ambos la presencia de una mutación 1861C>T que genera el cambio de arginina por cisteína en la posición 621 R621C; esta mutación no fue encontrada en 702 cromosomas de voluntarios alemanes sanos.32 Finalmente, se sabe que quienes tienen antecedentes familiares cuya EPE inició antes de los 67 años poseen un riesgo relativo RR de 2.3 de padecer la enfermedad el cual no se modifica si la EPE aparece después. 23 Un estudio longitudinal en Iceland que incluyó 560 pacientes con EPS de aparición después de los 50 años demostró que el RR de padecer EPE con un IC de 95% fue de 6.7 (4.3-9.6) para hermanos; 3.2 (1.2-7.8) en descendentes y 2.7 (1.6-3.9) para tíos y sobrinos, estos investigadores concluyeron que el factor genético es tan importante como el ambiental en la génesis de la EP que aparece después de los 50 años.33 Por otro lado se han estudiado al menos 16 genes nucleares relacionados con la etiología de la EPE en diferentes poblaciones, de éstos 9 se han caracterizado y se ha demostrado que participan en a la vía de degradación proteica en el proteasoma que les confiere vulnerabilidad asociada a la edad y al balance Ach/dopamina; el cromosoma 7 ACHE/PON locus 1 parece que ser una región clave para el control de este balance.34 Haciendo un recuento de la revisión anterior consideramos que evaluar las dos mutaciones mas frecuentes documentadas G2019S Y G2385A en el LRRK 2 (Gen más claramente involucrado en EPE) podría darnos información sobre su asociación en población mestiza mexicana con EPE.

Otro elemento fundamental en la patógena de la EPE es la evaluación de DNA mitocondrial (mDNA), para entender mejor este punto es necesario hacer un breve recordatorio de los aspectos fisiopatológicos y la importante intervención de la mitocondria en el proceso de muerte celular en esta enfermedad; sí bien la etiología de la EPE se desconoce, se sabe que existe un defecto en los neurotransmisores centrales a consecuencia de una pérdida más o menos selectiva de las neuronas productoras de dopamina, localizada en la parst compacta de la sustancia nigra y aunque hay otras neuronas que se pierden, éstas son las mejor estudiadas ya son las responsables de los problemas motores en la EP;35,36 está ampliamente demostrado que la muerte neuronal y la disminución de neurotrasmisores son eventos centrales en la enfermedad y aún es motivo de un afanosos estudios el origen de estos sucesos;37 la parts compacta de la sustancia nigra tiene alrededor de 450 000 neuronas dopaminérgicas, las cuales disminuyen con la edad, sin embargo, en los enfermos con EPE este proceso se encuentra “acelerado” y “anticipado”;,38 el parkinsonismo observado posterior a la epidemia de gripe asociada a encefalitis de Von Ecónomo a principios del siglo pasado fue el primer suceso que hizo suponer la influencia de eventos externos asociados al desarrollo de la EPE, una observación posterior de gran trascendencia en la compresión de la EPE, fue la asociación de un cuadro parkinsónico severo asociado a la exposición de MPTP (1 Metil, 4 Fenil, 1,2,3,6 Tetrahidropiridina),39,40 donde se pudo documentar la declinación de las células dopaminérgicas, así como de los precursores de dopamina, seguido de una inesperada perpetuación del fenómeno, lo que permitió obtener un modelo humano e in vivo de la enfermedad. A partir de estas observaciones se ha especulado que posiblemente la exposición a uno o varios agentes externos, en una etapa temprana de la vida, en un individuo con predisposición genética dispare los mecanismos de muerte celular mediada por apoptosis.Error: Reference source not found,41,42 Aquí dos puntos críticos aun no resueltos ¿por qué la selectividad de la muerte neuronal? y ¿cuáles son los mecanismos pre-existentes (predisposición genética)? Dos aspectos llamativos ocurren en las neuronas susceptibles a morir: la Disfunción Mitocondrial y en el Metabolismo Oxidativo,Error: Reference source not found,Error: Reference source not found,Error: Reference source not found elementos clave encontrados en la exposición de MPTP.

La disfunción mitocondrial.- el MPTP tiene efectos inhibitorios sobre el Complejo I (NADH-Obiquinona de Oxidoreductasa) en la cadena de transporte iónico mitocondrial lo cual produce la liberación de poderosas sustancias oxidantes y radicales libres de oxigeno. Un hecho relevante es que se han evidenciado cambios en el mtDNA (DNA mitocondrial)Error: Reference source not found,Error: Reference source not found como preludio de una cascada metabólica donde participan activamente mecanismos de excitotoxicidad, niveles inadecuados de factores neurotróficos, expresión de epítopes del HLA (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) y quizá, un metabolismo anormal de los precursores de dopamina, lo que en conjunto contribuyen en el daño y muerte neuronal.43 La vinculación entre las alteraciones del mtDNA y la muerte de la neurona es motivo de especulaciones y acucioso estudio, es pues pertinente recordar algunas particularidades del material genético contenido en las mitocondrias humanas. El mtADN se autorreproduce de manera semi-automática cuando la célula divide, al igual que el ADN bacteriano es una molécula bicatenaria, circular, cerrada, sin extremos. En los seres humanos esta constituido por 16.569 pb, conteniendo un pequeño número de genes distribuidos en dos cadenas H y L (pesada y ligera). Cada mitocondria contiene entre 2 y 10 copias de la molécula de ADN, en él están codificados dos ARN ribosómicos, 22 ARN de transferencia y 13 proteínas que participan en la fosforilación oxidativa. El número de genes en el mtADN es de 37| en contraste a los 20.000-25.000 genes del ADN nuclear humano). El mtADN se hereda solo por vía materna, tradicionalmente se ha considerado que cuando un espermatozoide fecunda un óvulo éste se desprende de su cola y con ella del material citoplasmático, sin embargo, se ha demostrado que las mitocondrias del espermatozoide pueden penetrar en el óvulo, pero no llegan a heredarse ya que son marcadas por la ubiquitina y degradadas. Otra característica importante mtADN es que no se recombina, por lo que los únicos cambios son debidos a mutaciones a lo largo de generaciones; la proteínas que se generan a partir del mtDNA intervienen en la fosforilación oxidativa de la cadena respiratoria, aportan un número especifico de proteínas para cada uno de los complejos de esta cadena (Complejos I al V) y aunque su participación es importante no todas son codificadas por el mtDNA ya que otras son transcriptos del DNA nuclear y así esta función indispensable para la obtención de energía celular es a partir de una quimera genética.44 Los cálculos han concluido que, en los mamíferos y en concreto en el hombre, cada 10.000 años aproximadamente surge una mutación en una de las bases del mtADN (esto no es del todo cierto, aunque sí lo es para el fragmento que más mutaciones sufre, este consta de unos 500 pares de bases); es decir, la diferencia entre una mujer que hubiera nacido hace 40.000 años y un descendiente directo por vía materna que viviera en la actualidad sería por término medio de 4 bases mutadas en esta región. Bryan Sykes45 profesor de Genética Humana en el Instituto de Medicina Molecular en Oxford asegura que todos los europeos provienen de siete mujeres, las siete hijas de Eva, la más antigua habría vivido hace 45.000 años y la más moderna hace unos 15.000 años. La antepasada común más moderna de todos las seres humanos, se remontaría a unos 150.000 años. Este conocimiento es de vital importancia para realizar antropología forense en diferentes poblaciones. A partir del conocimiento de que, las neuronas “marcadas” para sucumbir en la EPE presentan cambios en el mtDNA y disfunción de este organelo diferentes investigadores han centrado sus estudios en estos eventos.46 El estudio del mtDNA en el EPE no ha sido tan exhaustivo como del DNA nuclear, sin embargo, éste como los sucesos asociados a las fallas de la fosforilación oxidativa, la ubiquitinación proteína y su degradación proteosómica han motivado exhaustivas investigaciones. Sí bien la inhibición del el complejo I de la cadena respiratoria -CICR- (cadena de transporte de electrones) mitocondrial tanto en la sustancia nigra (SN) como en las plaquetas es un acontecimiento que se ha observado de manera consistente,47 la manera que participa el mtDNA es todavía motivo de investigación en la forma esporádica a enfermedad. El mtDNA codifica siete sub unidades proteicas CICR de ello su vinculación con el riesgo de padecer EPE;48 análisis bioquímicos utilizando células citoplasmática híbridas (Cybrids) han demostrado defectos en el CICR en pacientes con EPE lo que ha llevado a hipotetizar que aberraciones en el mtDNA pueden favorecer la EPE;49 Muy significativo fue observar que estos sistemas Cybrids producían una cantidad excesiva de moléculas reactivas de oxigeno lo que generaba aumento del estrés oxidativo y ello incrementaba la expresión de proteínas antioxidantes (bcl-2 and bcl-XL), esto es interpretado como una “señal” de estrés celular y como consecuencia a esta señal se genera la formación de mitocondrias anormales con cuerpos de inclusión proteicos; modelos experimentales han demostrado que los inhibidores de la actividad del CICR –rotenona- produce manifestaciones clínicas de la EP, estas manifestaciones se asocian a degeneración selectiva de neuronas dopaminérgicas en las sustancia nigra y acumulación citoplasmática de ubiquitina y alfa sinucleina; estos hallazgos sustentan que las alteraciones del CICR podrían ser el mecanismo primario en la susceptibilidad a la muerte neuronal en la EP y la implicación del mtDNA en la génesis de la EPE;.50,51 en base a lo anterior algunos investigadores han estudiado la disfunción en la expresión mtDNA en la EPE y pese a que se han observado no han sido suficientemente explicados.

En 2003 van der Walt y cols.52 evaluaron SNPs (Polimorfismo de Nucleótido Único) del mtDNA en 609 pacientes con EPE y 340 controles todos europeos de raza blanca, fueron clasificados de acuerdo a la caracterización europea en haplogrupos; los haplogrupos J y K demostraron asociarse a una disminución en el riesgo de padecer EP (RR de .55; IC .34-.9; p < .02 y RR 0.52, IC 0.30–0.90; p .02 respectivamente) el SNP 10398G mostró un potente efecto protector (RR 0.53; IC 0.39–0.73; p .0001) efecto que fue mayor en el genero femenino (RR 0.43; IC 0.27–0.71; p .0009); también encontraron que SNP 9055A de ATP6 poseía un efecto protector solo en las mujeres estudiadas (RR 0.45; IC 0.22–0.93; p .03). El SNP 10398G produce un cambio no conservativo de treonina por alanina dentro del NADH deshidrogensa 3 (NAD3) del CICR lo que, al parecer, reduce el estrés oxidativo. Autere et al.53 determinaron el total de sustituciones no sinónimas vs. sinónimas en los 7 genes del mtDNA que codifica para el CICR de en 230 pacientes con EP, ellos encontraron que, de acuerdo a las clasificación europea por haplogrupos, aquellos cercanos a HV y KU presentaron menor número de aminoácidos remplazados y una menor relación de sustituciones no sinónimas vs. sinónimas JT y IWX. En los haplogrupos JTIWX hubo mayor número de aminoácidos remplazados en los pacientes con EP que desarrollaron demencia; estos investigadores concluyeron que un exceso de mutaciones no sinónimas en los genes mitocondriales que codifican para el CICR en JTIWX incrementa el riesgo de que los pacientes con EP progresen demencia. Ghezzi et al.54 evaluaron mtDNA en 620 pacientes italianos con EPE no encontraron diferencias en las frecuencias en el haplogrupo J SNP 10398G como otros estudios, en tanto que el haplogrupo K fue significativamente menor entre los pacientes con EPE de aquí que este haplotipo le confiera cierto efecto protector en la población estudiada. En 2005 Huerta y cols.55 evaluaron 271 pacientes con EPE y 230 controles en una población del norte de España (provincia de Asturias) encontraron una mayor frecuencia en al SNP 4336T/C SNP del gen tRNA con el alelo 4336C en mujeres con EP (RR= 4.45; 95% IC=1.23–15.96; p =0.011). De los genes del CICR que fueron secuenciados (ND1 a ND5) en quienes fueron positivos para 4336C sin que se encontraran mutaciones. Este grupo también encontró que la frecuencia de 10398G era menor en pacientes con EP (p =0.009; RR =0.53) Esta investigación, en nuestra opinión, es la de mayor importancia para sustentar nuestro estudio por las semejanzas entre esta población y la población mestiza mexicana, los autores concluyeron que el alelo 4336C incrementó el riesgo de padecer la enfermedad entre mujeres y el 10398G tuvo un efecto protector en ambos géneros. Estos mismos autores un una publicación posterior buscando vinculación entre los genes de la sintetaza de Oxido Nítrico (SON) y EPE estudiaron a 450 pacientes con EP y 200 controles ratificaron el hallazgo de su anterior publicación y no hubo asociación con ningún gen que codificara para SON.56

4. objetivo(s)

constituyen las metas hacia las cuales están orientados los intereses del investigador. deben ser pertinentes, factibles y trascendentes.

  1. Conocer sí de la mutación GS2019s del gen LRRK2 se encuentra asociada al EPE,

  2. Conocer sí la mutación G2385a del gen LRRK2 en pacientes con EPE.

  3. Conocer la frecuencia de SNP A0398G en el gen ND3 y T4336C del ADN Mitocondrial en pacientes con EPE.

  4. Sí esto se estable, entonces es posible establecer haplotipos y/o haplogrupos potenciales de susceptibilidad y en base a la correlación con criterios diagnósticos internacionalmente aceptados establecer el riesgo y/o el curso clínico de la enfermedad


5. justificación

Argumentación que explica todos aquellos satisfactores que se consideran relevantes para la unidad, el instituto, el país y para la ciencia médica.

La EPE es una de las enfermedades nerurodegenererativas más frecuentes en el mundo; en México se calcula una prevalancia de 8-12 por 1000 en población general. Esta enfermedad afecta negativamente en el desempeño familiar, social y laboral del individuo quien suele percibirse como una “carga” para sus allegados; el impacto económico por pérdida laboral no esta cuantificado en nuestro país pero en naciones de primer mundo representa una gran carga para el estado, y en este tenor, siendo un padecimiento crónico, progresivo e incurable la erogación en los diversos gastos por atención medica van incrementándose logarítmicamente después de los cinco años de enfermedad; esto ubica al padecimiento como un problema de salud publica. Más aún, en el conocimiento de que la población de nuestro país ha incrementado sus esperanza de vida y éste, como otros padecimientos similares aumentan su frecuencia en relación directa al aumento de la edad. Otro elemento muy trascendente, es el conocimiento de que la EP tiene una fase subclínica de alrededor de cinco años -entre el inicio de la perdida neuronal y el primer síntoma- lo que nos ofrece una posible ventana diagnóstica y terapéutica temprana por lo que encontrar una herramienta para detectar estos individuos es uno de los propósitos de este estudio. En este contexto, pese a que este es un problema de salud (segunda causa de enfermedad neurodegenerativa) no se han evaluado los genes involucrados en la enfermedad en individuos mestizos mexicanos lo que podría ofrecernos, al menos, parte del instrumento que estamos buscando; esta población posee características genotípicas propias de ello la necesidad de conocer sí la enfermedad esporádica se asocia a ciertos cambios en el genoma nuclear identificado en otras poblaciones. La aportación más valiosa que nosotros visualizamos en esta investigación es la determinación de SNPs en genes mitocondriales dadas las implicaciones bien demostradas de este organelo en la fisiopatología de la EPE y las particularidades del la estructura y comportamiento del genoma mitocondrial. En este momento se sabe que diferentes eventos participan en la generación de la EPE y se acepta que sus génesis de multifactorial donde elementos del ambiente pueden incidir o disparar la parición de la EPE pero en un sistema biológico susceptible. Diferentes genes parecen tener coparticipación, sin embargo, parecen estar más relacionados con las formas hereditarias de la enfermedad, es decir aquellas de aparición temprana y patrones de segregación familiar bien establecidos. Algunos de los genes que se han encontrado en pacientes afectados con EPE entre ellos el gen LRRK2 este gen inicialmente se encontró en pacientes japoneses con formas autosómicas dominantes de la enfermedad. En población vasca se encontraron diferentes mutaciones K1114K, I1122V, R1441C, R1441G, Y1699C Y I2020T entre pacientes con la enfermedad, sin embargo, al evaluar individuos con EPE se encontró asociación con una mutación en particular, la 6055G>A que produce un cambio aminoacídico el G2019S en el dominio MAPKKK involucrado en la transducción de señales y un efecto sobreactivador hiperfosforilando sustratos. La frecuencia de la mutación en pacientes con EPE es mayor que en la población control, si bien la homocigosidad de la mutación no ha demostrado poseer un efecto más ¿sobreactivador? en sus efectos como era esperable su estudio será . Una segunda mutación del gen LRRK2, LA 7153G>A que produce un cambio aminoacídico G2385R sin se conozcan los efectos funcionales. Si bien hay una gran numero de de genes nucleares involucrados elegimos aquellos que más solidamente se han asociado a la EPE. En relación al genoma mitocondrial, la cantidad de estudios son sustancialmente menores y en población blanca; los genes involucrados en la codificación de las subunidades proteicas del CICR. El SNP T4336C se ha asociado a un riesgo mayor de padecer la EPE en tanto A10398G se ha documentado su efecto protector, este último ha sido documentado en varios estudios de ello que sea evaluado en nuestros pacientes.

6. Diseño

Forma previamente definida, en la que los elementos serán sujetos a las condiciones establecidas en el estudio.

6.1. Tipo de Investigación

Estudio, transversal, analítico, abierto y comparativo
6.2. Grupos de Estudio

6.2.1. Grupo problema. Grupo que incluye los factores que se espera modifiquen las variables en estudio

  1. Pacientes diagnosticados con Enfermedad de Parkinson en base a los criterios del banco de cerebros del Reino Unido

  2. Ambos géneros, mayores de 40 años

  3. Mestizos mexicanos

  4. acepten participar en el estudio


6.2.2. Grupo testigo. Grupo similar al problema en las variables relevantes pero que no incluye los factores que se espera modifiquen las variables en estudio.

Señalar si el estudio incluye este grupo ( X )

  1. Sujetos sin padecimientos neurológicos, mayores de 65 años.


6.2.2.1. Tamaño de la muestra.

Asumiendo una relación de caso:control 1:2 y una diferencia de 0.14 en la frecuencia de los genotipos de interés, con un valor de significancia (α) de 0.05 para 2 colas de distribución y un poder de 0.80, se obtiene el siguiente tamaño de muestra:

group 68

25

.09 (25+.9)/ 2 = .17

p = .17 q = .93

group 75


group 61


Casos = 86 ≈100

Controles = 172 ≈200


6.2.2.2. Criterios de inclusión. Aspectos que necesariamente deberán tener los elementos en estudio


  1. Pacientes diagnosticados con Enfermedad de Parkinson en base a los criterios del banco de cerebros del Reino Unido

  2. Ambos géneros, mayores de 50 años

  3. Mestizos mexicanos

  4. Aceptación del paciente y firma de Carta de Consentimiento Informado.


6.2.2.3. Criterios de exclusión

Todos aquellos datos cuya existencia obligue a prescindir del sujeto como elemento de estudio, a pesar de reunir los requisitos de inclusión.

  1. Síndromes de Parkinson -Plus & Atrofia de Sistemas Múltiples. Enfermedad neurológica de conocida trasmisión mendelina.

  2. Parkinsonismo secundario

  3. Enfermedad neurológica progresiva de cualquier naturaleza.



6.2.2.4. Criterios de eliminación

Causas que obliguen a retirar al sujeto como elemento del estudio una vez que ha sido incluido en la investigación

  1. Muestras que no sean procesadas adecuadamente.

6.3. Cédula de recolección de datos (Adjuntar)

Formato donde se anotarán todas las variables por investigar y que se llenará con los datos de cada elemento en estudio


6.4. Descripción general del estudio

Detallar el cuándo, cómo, qué, a quién. Incluir los instrumentos que se usarán para la recolección de datos
group 7


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