Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del ipn, Unidad Irapuato
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Biodiversidad en México La región mesoamericana se extiende desde el Norte de la República Mexicana hasta parte de Centro América (Guatemala, Belice, El Salvador y Honduras) y se ha caracterizado por ser una de las zonas con mayor riqueza genética, además constituye el centro de origen y domesticación de varias especies cultivadas. Por sus características topográficas, climáticas, historia geológica, geográfica y biológica, nuestro país alberga una gran variedad de ecosistemas y por tanto una gran variedad de especies (Neyra-González y Durand Smith, 1998). México constituye uno de los 12 países megadiversos (en los que el 70% de la biodiversidad total del planeta se ha concentrado). Además, posee el cuarto lugar en diversidad de plantas y se ha estimado que contiene alrededor del 10% de la flora del planeta y que de ellas el 20 a 30% son endémicas (CONABIO, 2006). Con base a las caracteísticas topográficas y geológicas, que influyen en las características climáticas, del suelo y de la vida silvestre, se han reconocido 15 provincias fisiográficas: Península de Baja California, Llanura Sonorense, Sierra Madre Occidental, Sierras y Llanuras del Norte, Sierra Madre Oriental, Grandes Llanuras de Norteamérica, Llanura Costera del Pacífico, Llanura Costera del Golfo Norte, Mesa del Centro, Sierra Volcánica Transversal o Eje Neovolcánico, Península de Yucatán, Sierra Madre del Sur, Llanura Costera del Golfo Sur, Sierra de Chiapas y Oaxaca y Cordillera Centroamericana (Figura 1) (INEGI, 2006).  Figura 1. Provincias fisiográficas de México (INEGI, 2006). Además, México es considerado el centro de origen, domesticación y diversificación de algunos cultivos de interés económico y alimentario, estimaciones sugieren que más de 118 especies de plantas, pertenecientes a 70 géneros y 39 familias han sido domesticadas en nuestro país, dentro de las más importantes se considera al maíz, amaranto, calabaza, camote, chile, cacao, jitomate, vainilla y frijol común (Hernández-Xolocotzi, 1993; Neyra González y Durand Smith, 1998). Sin embargo, la variabilidad genética de las especies cultivadas y sobre todo de las especies silvestres mexicanas ha sido poco estudiada. En México y en el mundo, organizaciones educativas e institutos de investigación están colaborando en la conservación de los recursos genéticos. En nuestro país, principalmente el Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y otras Universidades se encargan de esa importante labor. Marcadores moleculares empleados para medir la diversidad genética La diversidad genética puede medirse en dos niveles: fenotipo y genotipo. A nivel del fenotipo se describen los caracteres individuales o rasgos morfológicos que resultan de un genotipo y de su interacción con el ambiente, mientras que a nivel de genotipo se mide la constitución genética particular de un organismo. Una diferencia fenotípica o genotípica puede actuar como marcador genético si identifica en un individuo y puede hacerse un seguimiento a su herencia a través de varias generaciones (www.ipgri.org). Marcadores morfológicos y agronómicos Los marcadores morfológicos evalúan la variación fenotípica y miden características que definen forma y apariencia de un conjunto de individuos y las debe determinar un experto en la especie. Sin embargo este tipo de marcadores está sujeto a cambios debido a factores ambientales y pueden variar en las diferentes etapas de desarrollo del organismo; además su número es muy limitado (Gepts, 1993). Marcadores bioquímicos El avance y la disponibilidad de nuevas técnicas de laboratorio permitieron superar las limitaciones de los marcadores morfológicos, desarrollando marcadores bioquímicos basados en la detección de polimorfismos, es decir, diferencias detectables en un grupo de individuos. Los marcadores bioquímicos más empleados han sido las proteínas de reserva, se comparan los patrones enzimáticos obtenidos mediante electroforesis, se pueden detectar diferencias genotípicas con base a sencillas bases moleculares. Cubren el genoma entre 10 a 50 loci, dependiendo de la especie; sin embargo, el polimorfismo es bajo; aunque sencillo de realizar y de bajo costo. Al igual que los marcadores morfológicos, éstos también son limitados por la influencia del ambiente y los cambios que ocurren a diferentes etapas del desarrollo. Las principales ventajas de esos marcadores es la presumible neutralidad selectiva que permite distinguir similaridades debidas a la ancestría común o a la convergencia evolutiva (Gepts, 1993). Isoenzimas Las isoenzimas (diferentes formas moleculares de enzimas que presentan especificidad por el mismo sustrato o la misma actividad catalítica) y aloenzimas (isoenzimas cuya síntesis es controlada por los alelos codominantes de un gen) son proteínas con actividad catalítica que permiten conocer la variabilidad genética dependiendo del polimorfismo de sus formas moleculares y genéticas. Los genes que codifican las isoenzimas poseen dos propiedades que los hacen interesantes: 1) una porción importante de esos genes es polimórfica (dos o más alelos) y 2) los alelos de los genes codificadores de las enzimas son generalmente codominantes (Parker et al., 1998). Faseolina Las proteínas de semillas empleadas como marcadores exhiben un alto nivel de polimorfismo y generalmente un alto nivel de estabilidad ambiental, pero las complejas bases moleculares de sus patrones electroforéticos y de bandeo hacen difícil relacionar cambios fenotípicos con cambios a nivel molecular, además de su bajo número de loci involucrados (menos de 10) (Gepts, 1993). La faseolina, principal proteína de reserva del frijol es un marcador co-dominante que se hereda como una simple unidad Mendeliana, y se ha usado en análisis evolutivos para determinar centros de domesticación y patrones de distribución del frijol común. Marcadores genéticos basados en el ADN Un marcador genético es un carácter cuantificable que puede detectar variación en la secuencia de ADN. Se basan en la evaluación genotípica y presentan altas ventajas en comparación con los marcadores morfológicos y bioquímicos, son ilimitados y más informativos ya que abarcan todo el genoma, polimórficos y no son influenciados por el ambiente o el estadío de desarrollo, confiables y reproducibles; sin embargo, son más costosos y requieren un equipo complejo. Existen diferentes tipos y sus características son resumidas en el Cuadro 2. Los marcadores genéticos son altamente versátiles en sus aplicaciones, así por ejemplo, marcadores que abarquen un gran número de loci, como son AFLP, RFLP o RAPD. Se pueden usar para medir diversidad genética y diferenciación de la estructura genética de una población, estimar las tazas de flujo génico o migración o para mapeo genético e identificación. Para la caracterización de sistemas de apareamiento, análisis de paternidad y parentesco, caracterización de patrones de flujo génico o migración dentro de una población, control de calidad de variedades, huella de DNA y verificación de cruzas, se requiere un alto poder discriminativo y los microsatélites son los más convenientes. Finalmente, para aquellas aplicaciones que requieren información de secuencias para análisis de filogenia y taxonomía son indispensables las técnicas de PCR y secuenciación. Microsatélites (SSR) Los micro y minisatélites consisten en secuencias cortas (1-10 pb y 2-3 pb, respectivamente) que se repiten en serie. Son altamente variables y representan muchos loci dispersados en todo el genoma, que pueden tener varios alelos por locus, de manera que las hibridaciones con DNA genómico producen una individual y específica huella de DNA. Para identificar los polimorfismos se construyen cebadores de PCR para la región del ADN que flanquea el micro o mini satélite debido a que tienden a aconservarse dentro de las especies (Kochert, 1994). Cuadro 1. Características de los marcadores moleculares.  a Adaptado de Tecnologías de marcadores moleculares para estudios de diversidad genética de plantas. IPGRI y Universidad de Cornell (2003) Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Esta fue una de las primeras técnicas empleadas para detectar variaciones en la secuencia del ADN y se basa en la comparación de patrones de bandeo generados a partir del ADN de diferentes individuos que han sido sometidas a digestión con enzimas de restricción. Los patrones de variación observados se deben a las diversas mutaciones que afectan la secuencia del ADN produciendo fragmentos de longitud variable que son separados mediante electroforesis que hibridan mediante Southern blot con una sonda específica diferenciando sólo algunos fragmentos de restricción. Dependiendo de la especie analizada es el nivel de polimorfismo obtenido y estos marcadores cubren ampliamente el genoma a estudiar. Polimorfismo de ADN amplificación al azar (RAPD) Esta técnica está basada en el PCR con iniciadores de secuencia arbitraria (generalmente de 10 pb) que amplifica fragmentos de ADN al azar, es decir, sin que se busque un fragmento específico. Los fragmentos se separan y detectan mediante electroforesis. La presencia de cada producto de amplificación identifica la secuencia homóloga de nucleótidos completa o parcial entre el ADN genómico y los oligonucleótidos del iniciador, de tal manera que cada primer amplificará directamente varios loci en el genoma, haciendo una eficiente selección del polimorfismo de secuencias de nucleótidos entre individuos (Williams et al., 1990). Este polimorfismo, representado como presencia o ausencia de productos amplificables, es resultado de la variación alélica entre dos individuos (Parker et al., 1998). Polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) Esta técnica es una combinación de RFLP y PCR, está basada en la amplificación selectiva de fragmentos obtenidos a partir de la restricción del DNA genómico. Se emplea para caracterizar ADN de cualquier origen y complejidad. Consta de cuatro etapas: 1) El DNA genómico se corta con dos enzimas de restricción (EcoRl y Msel), formando una gran cantidad de fragmentos de diferente peso molecular. 2) A los fragmentos generados se les ligan en los extremos adaptadores (oligonucleótidos de DNA de doble cadena) con una secuencia base y el extremo cohesivo a la secuencia de corte de la enzima de restricción, generando un templado que servirá como sitio de unión a los iniciadores en la amplificación posterior. 3) La preamplificación se realiza adicionando una base selectiva en el extremo 3´ que permita amplificar una gran cantidad de fragmentos selectivos, los cuales son diluidos y utilizados como fuente ilimitada de templados. 4) En la segunda etapa de amplificación, los iniciadores tienen tres bases selectivas por lo que se reduce el patrón de bandas, lo que facilita la interpretación de la información en el gel. 5) Finalmente se separan los fragmentos amplificados mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida (Vos et al., 1995). Los AFLP se pueden ser usar para DNA de cualquier origen y complejidad, sin requerir un conocimiento previo de la secuencia de su genoma. Esta técnica provee un gran número de polimorfismos. En general hay una correlación lineal entre el número de fragmentos amplificados y el tamaño del genoma; sin embargo, en genomas complejos como el de plantas superiores se pierde esta correlación. Además, permite diferenciar individuos en una población, hacer análisis de paternidad, de flujo genético, e identificación de cultivares, y construir mapas genéticos de alta densidad, ya que el polimorfismo detectado es hasta cuatro veces mayor que en RAPDs, RFLPs y SSRs. JUSTIFICACION El papel que el frijol común tiene en la alimentación de nuestro país es obvio, una dieta típica incluye un 15% de frijol y un 65% de maíz, por lo que esta leguminosa es la segunda fuente de proteína, energía y minerales de la población mexicana. En este sentido, el frijol cultivado es una buena fuente de algunos de nutrimentos pero presenta deficiencias en otros. Tampoco puede pasarse por alto el papel nutracéutico de los compuestos que recientemente se han encontrando en el frijol común. Debido a que el fríjol es un alimento de gran importancia en la dieta en nuestro país y porque cuenta con una gran variedad de materiales de fríjol por ser centro de origen y domesticación de este cultivo, es necesario establecer actividades que tengan como objetivo evitar la pérdida del frijol criollo y silvestre, y caracterizar estos materiales desde un punto de vista nutricional, agronómico, molecular y bioquímico para conocer su potencial para mejorar al frijol comercial. El estudio de las características del fríjol silvestre, permitirá encontrar materiales con aspectos sobresalientes, que puedan ser utilizados en programas de mejoramiento de fríjol cultivado otorgándole mejores cualidades nutricionales y funcionales así como mayor variabilidad genética como solución a la escasa variabilidad presentada por el frijol cultivado (Gepts, 1998; Beebe, 1999; Frossard y col., 2000). Este estudio específicamente, nos permitirá encontrar materiales con características sobresalientes a nivel de contenido de proteína y minerales, que son las principales características nutricionales del fríjol, así como los contenidos de fibra dietaria y oligasacaridos, ambos componentes funcionales o nutracéuticos, que está involucrado en la prevención de cáncer de colon, a una mayor absorción de los nutrimentos en el tracto digestivo; y prevención de cáncer y actividad antioxidante respectivamente. Los materiales con características notables podrán ser utilizados en programas de mejoramiento nutricional de fríjol cultivado. Esta información será proporcionada a fitomejoradores de este cultivo cuya finalidad será obtener frijoles que aporten mayores beneficios nutricionales, funcionales y sobre todo preventivos de enfermedades crónicas al ser consumidos por la población mexicana. OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECIFICOS.
Hipótesis Existen materiales silvestres y domesticados que contienen mejores concentraciones de proteínas y minerales, así como mejores componentes nutracéuticos (fibra), que los materiales cultivados. Se pueden relacionar estas características ventajosas con los marcadores genéticos de cada material. Materiales y Métodos Material biológico Se analizaron 34 materiales criollos, 22 materiales mejorados y 64 materiales silvestres, para efectos comparativos se incluyeron los materiales cultivados: “Jamapa” y “Pinto”. La mayoría de los materiales fueron obtenidos de la colección del instituto Nacional de Investigación Agrícola y Forestal, Unidad Bajío, localizado en Celaya, Gto. Los materiales criollos y silvestres fueron provenientes de los estados de Aguascalientes, Durango, Chihuahua, Guanajuato, Guerrero, Jalisco, Michoacán, Nayarit y Oaxaca. Los materiales se crecieron en el invernadero para recuperar material vegetativo suficientes para los diferentes experimentos. Extracción de DNA La extracción de DNA se realizó con el método de Doyle y Doyle (1989), con algunas modificaciones. Se pulverizaron hojas jóvenes congeladas con nitrógeno líquido con un homogenizador Cafrano CSA (Tipo RZR. Notario, Canada) y se homogenizaron con 600 ul de buffer de lisis (100 mM Tris-HCL pH 8.5; 20 mM NaCL; 20 mM EDTA pH 8.0; 20% N-Laurilsarcosina (SIGMA-Aldrich). Se adicionaron 5 ul de RNAsa 10 mg/ml, y se incubó a temperatura ambiente por 15 minutos. Se extrajeron las proteínas con fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1 v/v/v), la mezcla se centifugó a 12000 rpm durante 10 minutos, se recuperó el sobrenadante y se mezcló con 750 ul de isopropanol y se precipitó a -20 oC durante una hora. Se centrifugó la mezcla a 12,000 rpm y se recuperó la pastilla, se lavó con etanol 70% y se resuspendió en 100 ul de TE (10mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA). Se determinó la concentración por espectofotometría (D.O. 260). Las muestras se diluyeron a 100 ng /ul y se almacenaron a -20oC hasta su uso. |
