Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico




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TRABAJO PRÁCTICO N° 8- CITOQUÍMICA -MEDULOGRAMA
En el laboratorio de hematología, la citoquímica constituye un elemento de capital importancia y un complemento indispensable al la observación morfológica convencional para la identificación de las estirpes celulares. La citoquímica estudia la composición química de la célula y permite detectar la localización topográfica de algunos principios inmediatos, enzimas, metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de unión entre la morfología y la bioquímica  

En este trabajo se describirán las técnicas citoquímicas aplicadas con mayor frecuencia en la Hematología tradicional.
TECNICAS CITOQUIMICAS:
RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO ENZIMATICOS
Tinción histoquímica de hierro: coloración de Perls
La coloración de Perls pone de manifiesto la presencia de hemosiderina en el citoplasma tipo de célula pudiendo ser aplicada a las células presentes en un frotis o extensión de sangre o médula ósea. La hemosiderina es un derivado insoluble de la ferritina, que se considera el resultado de la precipitación de varias moléculas desnaturalizadas de apoferritina. Normalmente, constituye el hierro no hemínico de los eritroblastos y puede hallarse abundantemente en las células del sistema mononuclear fagocítico.

CONSIDERACIONES

  1. Frotis de la médula ósea bien extendidos en portaobjetos totalmente libres de hierro. Se debe tener cuidado de evitar toda contaminación por exceso de hierro que pueda contener el portaobjeto a utilizar en la coloración; para ello deberán ser sumergidos en una solución de HCl 3 mol/L como mínimo dos minutos o más para poder eliminar todo exceso de hierro.

  2. Solución clorhídrica de ferricianuro potásico. Debe prepararse extemporáneamente mezclando dos volúmenes iguales de una solución acuosa de ferricianuro potásico al 2% en agua destilada (20g/L) y otra en HCl 0.2 N durante 10 minutos a temperatura ambiente (24ºC).


METODO

  1. Fijar los frotis en metanol o etanol al 80% durante 10-20 minutos.

  2. Dejarlos secar a temperatura ambiente.

  3. Preparar en el momento la solución compuesta por partes iguales de ferrocianuro de potasio (20gr/L) y HCl 0,2M.

  4. Dejar actuar dicha solución durante 10 minutos.

  5. Lavar con agua de canilla durante 20 minutos.

  6. Enjuagar con agua destilada.

  7. Contracolorear con Hematoxilina durante 1-2 minutos.

  8. Dejar secar y luego observar en microscopio óptico.




Tinción de Perls en Anemia Sideroblástica Refractaria

Detección histoquímica de hemoglobina fetal: reacción de Kleihauer-Betke

FUNDAMENTO

La hemoglobina fetal (HbF o 22) es ácido y alcalirresistente. Por consiguiente, sometido un preparado fresco de sangre a una elución ácida será arrastrada la hemoglobina A y retenida la fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconoce por la coloración de estos últimos.

REACTIVOS

  1. Alcohol etílico al 80%

  2. Buffer de ácido cítrico, pH 3,4 constituido por dos soluciones:

Solución A:

Ácido cítrico............................ 4,2 g

Agua destilada......................... 100 ml

Solución B:

Citrato de sodio........................ 5,9 g

Agua destilada......................... 100 ml

Solución Buffer pH 3,4:

Solución A ................ 84 ml

Solución B................. 16 ml

  1. Eosina al 0,1 % en agua.


DESARROLLO

  1. Extendidos de sangre secos de no más de una hora de obtención, se fijan durante 5 minutos en el alcohol etílico al 80%

  2. Lavado rápido con agua y secado.

  3. Inmersión en una cápsula de Petri que contenga el buffer de citrato. Llevarlos a estufa a 37C un mínimo de 5 minutos, agitando cada dos minutos. Lavar rápidamente en agua común y secar en posición vertical.

  4. Colorear en 3 a 5 minutos con la solución de eosina. Lavar con agua y secar.


RESULTADOS

Los hematíes con hemoglobina fetal se colorean por la eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobina A han sido reducidos a sus membranas vacías y aparecen como sombras.

El análisis cuantitativo puede hacerse estableciendo el porcentaje de hematíes coloreados e incoloros.



Hematies con Hemoglobina Fetal
RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS ENZIMATICOS
PEROXIDASAS (MIELOPEROXIDASA)

Fundamento

Método de Washburn: frente al agregado de agua oxigenada, aquellas organelas que poseen la enzima desprenden oxígeno naciente del agua oxigenada y este oxida la bencidina a un óxido intermedio color azul oscuro al principio que luego vira al negro.

Reactivos

  1. Colorante (conservar en heladera y oscuridad)

Bencidina

300 mg

Solución saturada de nitroprusiato de Na

1 ml

Alcohol etílico absoluto

99 ml




  1. Solución H2O2-AcH

H2O2 (10 vol.)

2 gotas

H2O destilada

50 ml

AcH puro

1 gota

Preparar en el momento.

Procedimiento

  1. Fijar el extendido con metanol o etanol 80% durante 5 minutos.

  2. Dejar secar el extendido.

  3. Impregnar el extendido con la solución 1 durante 3 minutos.

  4. Volcar sobre la misma solución anterior la solución 2, dejar actuar durante 2 minutos.

  5. Pasado el tiempo tomar el extendido con alguna pinza y dejarlo verticalmente hasta que se seque.

  6. Contracolorear con una solución de Giemsa diluido 1/10 durante 20 minutos.

  7. Observar al microscopio óptico con aceite de inmersión.


Resultados

Positivo: citoplasma cubierto de color negro en aquellas células que poseen la enzima.



Reacción de Peroxidasa (+) en precursor mieloide

BIOPSIA Y ASPIRADO DE MEDULA ÓSEA - MEDULOGRAMA
La biopsia de médula ósea (BMO) se ha convertido en una herramienta útil en el diagnóstico de enfermedades hematológicas, de neoplasias primarias o metastásicas y estadificación de las mismas, de infecciones, y de enfermedades metabólicas. Para optimizar la valoración de la BMO, es necesario conocer los datos clínicos y de laboratorio, incluyendo los resultados de la sangre periférica y del aspirado de la médula ósea (MO), así como las posibilidades diagnósticas del médico tratante. Se debe contar con un procedimiento técnico adecuado para obtener y procesar la BMO. La médula ósea (MO) comprende entre 3.5 y 6% del peso corporal; es el principal órgano de hemopoyesis; es un órgano linfoide primario y secundario que proporciona un medio para la maduración celular y la interacción inmunológica; está influida por factores reguladores para la producción normal de células sanguíneas.

La hemopoyesis es el proceso de producción de elementos formes de la sangre, y está localizada en el compartimento extravascular de la MO. La hemopoyesis en la MO se inicia desde la mitad de la gestación, y es el mayor sitio de hemopoyesis al nacimiento. Durante el primer año de la vida la hemopoyesis tiene lugar en la MO de huesos axiales y radiales del esqueleto, y a partir de la mitad de la adolescencia los huesos planos centrales se convierten en los principales sitios de hemopoyesis.

Importa señalar que uno de los factores que modifican la hemopoyesis es la edad; los recién nacidos pueden tener una celularidad entre el 80 y 100% en la MO, mientras que en los ancianos de más de 70 años, la celularidad normal puede ser de menos del 50%. Conforme los niños crecen, la celularidad de la MO va decreciendo; en menores de 9 años la celularidad es del 78% ± 13, y de 10 a 19 años es de 72% ± 11. Las células progenitoras o células madre circulan en la sangre periférica y se alojan en la MO; de esta manera hay un suplemento continuo de células pluripotenciales, capaces de autorenovarse y diferenciarse en células destinadas hacia eritropoyesis, granulopoyesis, monocitopoyesis y megacariocitopoyesis.

Las células progenitoras pluripotenciales, además de dar orígen a los eritrocitos, granulocitos, megacariocitos y plaquetas, también generan linfocitos (linfopoyesis), células cebadas y macrófagos.
INDICACIONES

La BMO está indicada en todas las enfermedades que puedan afectarla, ya sea en forma primaria o secundaria. La indicación hematológica más frecuente corresponde a la disminución de elementos formes de la sangre periférica, las citopenias, leucopenia, anemia y trombocitopenia, ya sea en forma aislada o de las tres series (pancitopenia). Las citopenias periféricas pueden deberse a: 1) producción insuficiente de células en la MO; 2) incremento en su utilización periférica, por destrucción o por pérdida, sin una adecuada producción compensadora en la MO; 3) una combinación de estas causas.

El aspirdo de MO se utiliza frecuentemente para el diagnóstico de procesos proliferetivos ya sea para la observación microscópica como para la inmunomarcación y posterior identificación por citometría de flujo.

Las especialidades médicas que con mayor frecuencia solicitan la BMO corresponden a hematología, oncología, infectología y medicina interna.

Las indicaciones de la BMO se agrupan en Cuadro 1.


Cuadro 1: Indicaciones de BMO

- En pacientes con citopenias no explicadas previamente por los estudios hematológicos (incluye la evaluación de procesos mielodisplásicos)

- En la sospecha de infiltración de neoplasia con diagnóstico previo desconocido

- Para la estadificación oncológica de tumores con diagnóstico previo confirmado: linfomas, otros tumores sólidos como neuroblastoma, rabdomiosarcoma, etc.

- Para conocer la respuesta al tratamiento de algunas neoplasias: remisión, recaída, etc.

- Evaluación de la médula ósea antes del trasplante de células progenitoras

- En el estudio de pacientes con fiebre de origen desconocido: sospecha de agentes infecciosos como histoplasmosis, tuberculosis.

- En la evaluación de pacientes con enfermedad metabólica por depósito de material anormal


CONTRAINDICACIONES

No existe una contraindicación absoluta para la BMO. Se debe tener controlado al paciente con

tendencia a sangrar y conocer el tipo de tratamiento que puede ocasionar hemorragias: aspirina o anticoagulantes.
COMPLICACIONES

En general la BMO es un procedimiento relativamente bien tolerado y con bajo riesgo de morbilidad. Las complicaciones de la toma de BMO son raras; corresponden a 0.08%, generalmente debido a sangrados que pueden ocasionar hematomas. Otras complicaciones más serias son aún menos frecuentes, como la neuropatía transitoria, una infección de la herida y osteomielitis, reacción a medicamentos, así como dolor persistente. El riesgo de sangrado puede ser mayor en pacientes con trombocitopenia y alteraciones de la función plaquetaria; ellos deben tenerse en observación en el hospital por 24 horas después del procedimiento. La siembra de células malignas puede ocurrir excepcionalmente en pacientes con metástasis diseminadas.
TECNICA

La BMO se debe realizar exclusivamente por personal capacitado y con experiencia en la técnica. La BMO se puede tomar en forma uni o bilateral, generalmente de la cresta ilíaca posterosuperior. Para el estudio de enfermedades hematológicas, un fragmento es suficiente. Para el estudio de las neoplasias malignas, frecuentemente se toman biopsias de dos sitios diferentes: una de cada cresta ilíaca.

El sitio de donde se obtiene la biopsia debe ser de fácil acceso, con mínimo trauma y sin peligro para el paciente. En niños muy pequeños o en pacientes no cooperadores, la biopsia se toma bajo anestesia general. En lesiones óseas precisas es importante la guía con estudios de imagen.

La aguja para biopsia que más se usa, especialmente por los hematólogos, es la de 11 a 8 gauge, que obtiene una biopsia de 2 mm de diámetro, con una longitud de 1 a 2 cm, de acuerdo con la profundidad a la que se introduce la aguja.

El aspirado de MO debe efectuarse después de haber tomado la biopsia del tejido, colocando la aguja a 1 cm de esa zona; se hacen los frotis, y el material restante se puede colocar en tubos con anticoagulante para estudio con citometría de flujo, para estudios citogenéticos, etc.
MANEJO DEL TEJIDO

La biopsia de MO se debe fijar de inmediato en formaldehido con amortiguador (buffer) de fosfatos al 10%, cuando menos durante seis horas; posteriormente se coloca en solución descalcificadora, generalmente suficiente por 24 h.

Los cortes histológicos no deben exceder 4 micras de espesor. Las tinciones iniciales más usadas son hematoxilina y eosina, ácido periódico de Schiff (PAS), Giemsa, tinción para fibras reticulares (Sweet) y para hierro (Perls).

Se realizarán estudios adicionales con imunohistoquímica, si son necesarios, sobre todo para el diagnóstico diferencial de neoplasias.
INTERPRETACIÓN
Histología normal

En condiciones normales el tejido hematopoyético en los espacios medulares tiene una distribución y topografía especiales: los grupos de células eritropoyéticas, los megacariocitos y las formas maduras de la serie granulocítica, se localizan en sinusoides del centro del espacio medular, mientras que los precursores mieloides tempranos se localizan con relación a la superficie endosteal de las trabéculas óseas y en la vecindad de las arteriolas. Por lo tanto, las variaciones espaciales de las diferentes series son importantes en la interpretación. Las células madre no se identifican por la morfología tradicional en los aspirados de MO, aunque recuerdan a las células linfoides pequeñas. Las células madre se identifican por su función y por el inmunofenotipo que incluye la expresión de CD34, c-kit y Thy1, y están localizadas en la región endosteal de la MO.

Celularidad. La celularidad en la MO corresponde a la proporción entre las células hemopoyéticas y el tejido adiposo, que varía según la edad del paciente, es casi del 100% en recién nacidos y disminuye aproximadamente 10% conforme avanza cada década de la vida (Cuadro 2).

En los recién nacidos a término hay predominio de los precursores mieloides, que ocupan dos terceras partes de la celularidad, y disminuyen a un tercio al mes de edad. Los linfocitos en recién nacidos ocupan un 15%, y aumentan hasta 50% al mes de edad, lo que se prolonga hasta los 18 meses.

Relación mieloide:eritroide (RM:E). Se refiere a la proporción relativa entre el componente granulocítico y el eritroide; el resto de los componentes de la médula ósea (megacariocitos, linfocitos, células plasmáticas) no se toman en cuenta en esta relación.

En la primera semana de vida hasta el 70% de las células corresponde a la serie eritroide, principalmente proeritroblastos y eritroblastos basófilos, por lo que la RM:E en esta etapa de la vida está invertida, y es de 1:2.


Posteriormente el componente granulocítico aumenta y la relación se estabiliza entre 2.5:1 y 4:1 en adultos. La tinción de PAS acentúa la diferencia entre los dos componentes, ya que la serie granulocítica tiene citoplasma PAS positivo difuso. La IHQ con anticuerpos anti-mieloperoxidasa y anti-glucoforina, identifica con mayor precisión los dos componentes.




MÉDULA ÓSEA NORMAL
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