Métodos de obtención de fragmentos específicos de adn que permiten aislar, analizar y manipular genes individuales
descargar 12.76 Kb.
|
| Ingeniería genética: Técnicas de ADN recombinante Un hecho que constituyó uno de los avances más espectaculares de los últimos tiempos fue el desarrollo de técnicas que permiten la manipulación de los genes de diferentes especies en beneficio de distintas actividades relacionadas con la vida humana. Hasta los comienzos de 1970, el ADN era una molécula que presentaba amplias dificultades para su análisis bioquímico. Su gran longitud y complejidad, hacían que la secuencia de los nucleótidos sólo pudiese ser estudiada mediante mecanismos indirectos. Para ello se recurría a la secuencia de aminoácidos de las proteínas o de nucleótidos del ARN, pero de esta manera quedaban excluidas las secuencias no codificantes del ADN y los intrones. Hoy la situación ha cambiado por completo y el ADN puede ser estudiado mediante la utilización de técnicas de ADN recombinante que permiten, por ejemplo, separar regiones determinadas del ADN, obtenerlas en grandes cantidades y determinar su secuencia exacta de nucleótidos. También es posible alterar las secuencias de ADN produciendo versiones modificadas de los genes para producir un nuevo fenotipo, lo que tiene gran repercusión en áreas como la medicina y la industria. Algunas técnicas de ADN recombinante son:
Cómo la molécula de ADN presenta gran tamaño y complejidad, para descifrar la información genética y poder manipularla, es necesario obtener un tamaño de ADN posible de manipular, como así también, aislar los genes que se pretenden estudiar del resto del genoma. Para la obtención de fragmentos específicos de ADN, en ingeniería genética se utilizan las denominadas “enzimas de restricción”. Estas enzimas son sintetizadas por ciertas bacterias y son capaces de cortar el ADN en sitios (secuencias de bases) específicas. Las bacterias poseen estas enzimas como mecanismo de protección, cuando ingresa ADN extraño (por ejemplo viral) a una bacteria, las enzimas de restricción cortan la molécula de ADN extraño antes de que se replique. Una característica importante de estas enzimas es que cortan la molécula de ADN en secuencias específicas de cuatro o seis paras de bases. Estas secuencias se denominan “secuencias de reconocimiento”. Además, de acuerdo a la enzima de restricción que se trate, pueden cortar ambas hebras de ADN en diferentes sitios, dando lugar a extremos “pegajosos” que sólo pueden aparearse nuevamente si se encuentran con cadenas que presentan bases complementarias, o extremos “romos” que cortan ambas hebras de ADN en el mismo sitio y pueden unirse a otra cadena de ADN independientemente de la secuencia de bases que contenga.  Posteriormente, los fragmentos resultantes pueden ser separados mediante una técnica conocida como electroforesis en geles de agarosa. El método consiste en aplicar una corriente eléctrica a través de un gel, de modo que el ADN que tiene carga negativa, migre hacia el electrodo positivo. La velocidad de migración dependerá del tamaño de cada fragmento (los fragmentos de menor tamaño migran más rápidamente al polo positivo). El gel se coloca en una “cuba de electroforesis”, sumergido en un “buffer de corrida”. Las muestras que contienen ADN son colocadas en pocillos en uno de los extremos del gel. Al aplicarse corriente eléctrica, las moléculas de ADN migran a través del gel en función de su tamaño, desde el polo negativo al positivo.  Tras la corrida electroforética los diferentes fragmentos de ADN son separados y visualizados por medio de tinción.  La combinación entre digestión con enzimas de restricción y electroforesis en gel se denomina “análisis de restricción”. Luego estos fragmentos pueden ser extraídos del gel intactos.
Las técnicas de clonación permiten conseguir grandes cantidades de un segmento de ADN, lo que es importante cuando el ADN es limitante, como en el área forense y de identificación humana. Una de las técnicas empleadas consiste en utilizar vectores (como plásmidos o bacteriófagos). Los plásmidos son capaces de alojar trozos extra de ADN, lo que hace posible introducir una secuencia de ADN determinada en un plásmido circular, generando un ADN recombinante. De esta manera, el plásmido actúa como vector, capaz de llevar el trozo de ADN y replicándolo al mismo tiempo que se replica el plásmido. El procedimiento de clonación en vectores es el siguiente: 1º Se aísla la secuencia de ADN que se quiere insertar, mediante la utilización de “enzimas de restricción”, que generen extremos pegajosos. 2º Se trata el plásmido con la misma enzima, de modo que los extremos pegajosos del plásmido y los del ADN a insertar son complementarios. 3º Se inserta el fragmento de ADN en el plásmido y se deja replicar. La presencia del fragmento dentro del plásmido se reconoce por el tamaño de éste y se puede recuperar utilizando enzimas de restricción y electroforesis.
En la actualidad se utiliza el método de Frederick Sanger: “Método de Sanger”. Éste método consiste en utilizar compuestos denominados “terminadores de cadena”, los cuales son desoxirribonucleótidos modificados. Durante la replicación de una molécula de ADN, cuando la ADN polimerasa agrega por azar un “terminador de cadena” a la cadena de ADN en crecimiento, la síntesis de ADN se detiene. Para la realización del método de Sanger, se mezcla una cadena de ADN molde con cebadores (posibilitan el inicio de la replicación) y desoxirribonucleótidos “normales” (ATP, CTP, TTP, GTP). La mezcla se separa en cuatro tubos y, a cada uno de ellos se le agrega un terminador de cadena distinto (a uno una ATP modificada, a otro una GTP modificado, etc). Finalmente, se agrega la enzima ADN polimerasa en cada uno de los tubos y se inicia la síntesis. Durante la reacción, cuando por azar la ADN polimerasa incorpora un terminador de cadena, la síntesis de esa cadena se detiene y de este modo se van produciendo cadenas de ADN de distintas longitudes dentro de un mismo tubo. Así, los terminadores de cadena de Adenina, indicarán la presencia de Timinas en la cadena molde. Luego, mediante electroforesis en gel, se puede develar la secuenciación (en la actualidad este procesos se realiza de manera automática con marcación fluorescente en los terminadores de cadena leídos con láser).  |
