Resumen Los polihidroxialcanoatos (phas), son polímeros producidos como material de reserva por diversos grupos bacterianos que resultan de gran aplicación en biotecnología y en la industria farmacéutica.




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títuloResumen Los polihidroxialcanoatos (phas), son polímeros producidos como material de reserva por diversos grupos bacterianos que resultan de gran aplicación en biotecnología y en la industria farmacéutica.
fecha de publicación30.01.2016
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REVISTA BIOLOGÍA Vol.17, No. 1, 2003



Evaluación de la producción

de polihidroxialcanoatos

por cepas bacterianas marinas.

María E. Carballo*; Yenni Iglesias; Jorge Martínez; Rubén Solano; Ana I. Fernández;

Mario J. Villaverde. Facultad de Biología, Universidad de La Habana

Resumen

Los polihidroxialcanoatos (PHAs), son polímeros producidos como material de reserva por diversos grupos bacterianos que resultan de gran aplicación en biotecnología y en la industria farmacéutica. El presente trabajo muestra los resultados de la investigación realizada con cepas de origen marino de los géneros Pseudomonas y Bacillus, para las cuales se determinó la capacidad de producir el polímero en cultivo líquido agitado, así como los niveles de producción bajo diferentes condiciones de cultivo. Según los resultados obtenidos, el 71 % de las cepas estudiadas sintetizaron PHA y el medio de cultivo Agua de Mar Natural fue el más favorable para alcanzar los mayores niveles de producción del polímero.
Palabras clave: polihidroxialcanoatos, cepas marinas, Pseudomonas, Bacillus.
Abstract

The polyhydroxyalkanoates (PHAs), are polymers produced as reserve materials by diverse bacterial groups of great in application biotechnological and in biopharmaceutical industry. The present work shows the results of the research carried out with strains of marine origin of the genera Pseudomonas and Bacillus, for which was determined the capacity of producing the polymer under aerated liquid culture, as well as the production levels under different cultivation conditions. According to our results, 71 % of the strains under study synthesized the highest levels of polymer under the most favorable cultivation media, e.g. the one based on natural seawater.




Key Words: polyhydroxyalkanoates, marine bacteria, Pseudomonas, Bacillus.




Introducción

La contaminación ambiental es un problema de gran repercusión mundial. Entre los más fuertes contaminantes se encuentran los polímeros sintéticos, que poseen una larga vida al ser no biodegradables, por lo cual provocan un alarmante daño ecológico (Huisman et al. ,1992; Asenjo et al., 1995).
Como una solución a estos problemas se plantea la sustitución de estos polímeros por polímeros naturales como los ácidos polihidroxialcanoicos (PHAs), los cuales constituyen materiales de reserva no nitrogenados para una gran variedad de especies bacterianas, pero solo un pequeño número de especies los producen a niveles de interés industrial. Ellos constituyen materiales con excelentes propiedades para su aplicación en medicina, industria y biofarmacia ya que son biodegradables, termoplásticos y biocompatibles (Lee, 1996).

E-mail: mecarballo@fbio.uh.cu
Seleccionar nuevas cepas productoras de PHAs reviste una gran importancia y las fuentes marinas constituyen una alternativa para la investigación en este sentido. Estudios realizados por Weiner, en 1997, sobre las potencialidades productivas de los procariontes marinos, demostraron la capacidad de algunas bacterias de este origen para producir PHAs.
El objetivo de este estudio fue evaluar la capacidad de biosíntesis de estos compuestos (PHAs) por cepas aisladas de un ecosistema marino cubano, pertenecientes a los géneros bacterianos Pseudomonas y Bacillus y conocer la influencia que tienen algunas condiciones nutricionales sobre los niveles de producción de estos polímeros.

Materiales y Métodos


Microorganismos empleados: Fueron utilizadas 7 cepas aisladas de agua de mar, donadas por la Colección de Cepas Bacterianas del Instituto de Oceanología de la Academia de Ciencias, identificadas como: cepas (4) y (5) de Pseudomonas mendocina, cepa (6) de Pseudomonas fluorescens, cepas (63) y (223) de Bacillus cereus, cepas (1) y (66) de Bacillus thuringiensis.

Medios de cultivo:

Medio control (MC): Caldo nutriente ( 8 g.L-1), suplementado con glucosa (10 g.L-1 ) y NaCl ( 3.5 g.L-1 ), en agua destilada. pH 7.2, esterilizado a 121º C por 15 min.
Medio Rojo Nilo (MRN): Es el Medio Control agarizado, al cual se le adicionó, en proporción de 1 L por mL de medio estéril y fundido, una disolución de Rojo Nilo al 0.1% en acetona ( Page y Tenove, 1996 ).
Detección de cepas productoras del polímero: Las cepas bajo estudio fueron sembradas en línea recta de aproximadamente 10 mm de longitud en medio MRN e incubadas a 30 ± 2º C. A las 12, 24, 36, 48 y 72 horas de incubación se realizaron las observaciones de emisión de fluorescencia de los cultivos en un transiluminador Vilber Lourmat a una =365 nm. La evaluación fue visual: (0)= no fluorescencia, (estría de Escherichia coli como control negativo de no fluorescencia); (+)= fluorescencia rosada tenue, discernible del control negativo; (++) fluorescencia rosada evidente; (+++) fluorescencia rosada brillante.
Determinación del nivel de producción de PHA.- Las cepas fueron cultivadas en 20 mL del Medio Control, inoculadas al 5% a partir de un inóculo inicial de 24 h de incubación. Los cultivos se incubaron en zaranda a 30  2º C y 70 r.p.m. A los tiempos de 24, 48 y 72 h, fueron tomadas muestras para los análisis del crecimiento celular y producción de PHA.
Estudio de las condiciones nutricionales

que influyen en la producción de PHAs:

-Influencia de sales.- El efecto de la presencia de sales fue estudiado en el Medio Agua de Mar Natural (AMN) que consiste en eliminar del Medio Control el NaCl y sustituir el agua destilada por agua de mar natural.
Efecto de diferentes fuentes de nitrógeno: Las cepas 4 y 63 por su nivel de fluorescencia en el MRN, fueron cultivadas en el medio AMN en tres variantes donde se sustituyó el caldo nutriente por: 1)- Peptona bacteriológica 5 g. L-1; 2)-Extracto de levadura 2 g. L-1 y 3)- Extracto de carne 1 g. L-1.
Influencia de la fuente de carbono: A partir del medio AMN fueron formulados 5 medios de cultivo mediante la sustitución de la glucosa por diferentes fuentes de carbono: succinato de sodio, lactato de sodio, ácido láctico, glicerol, fructosa y xilosa, a la concentración de 10 g.L-1. Este estudio se realizó con la cepa 4. Todos los experimentos fueron inoculados e incubados en las mismas condiciones a las utilizadas con el Medio Control.
Determinaciones analíticas: El crecimiento bacteriano fue determinado mediante mediciones de absorbancia a =600nm. La cuantificación de PHA fue realizada por el método de Slepecky (1960).
Procesamiento estadístico: Fueron realizados análisis de varianza de clasificación simple y bifactorial. Para comparar las medias fue utilizada la prueba de rangos múltiples de Duncan. (Sigarroa,1985).

Resultados y Discusión


Selección cualitativa en placas MRN de las cepas que biosintetizan PHAs.

Los resultados de fluorescencia, en el Medio Rojo Nilo se reflejan en la Tabla I. Todas las cepas, con excepción de la # 1 y la # 223, emiten fluorescencia de color rosado de diferentes intensidades cuando son irradiadas con luz UV a 365 nm. Esto es debido a que, aunque el Rojo Nilo se encuentra en muy pequeñas cantidades en el medio de cultivo (0,0001%), es absorbido y acumulado en los gránulos de PHA, confiriéndole fluorescencia a la célula. Estos resultados permitieron determinar además, la dinámica de la biosíntesis del polímero; se observó que en las cepas número 4, 5, 6, 63 y 66, la biosíntesis comienza o se acentúa a partir de las 24 horas del cultivo y se hace evidente que la cepa 4 de Pseudomonas mendocina posee una elevada acumulación del polímero.
Según el Manual de Bergey (Holt et al., 1994) las especies del género Pseudomonas que producen pigmentos fluorescentes se clasifican como no productoras de PHA, lo cual se contradice con estos resultados para la cepa 6 identificada como Pseudomonas fluorescens. La literatura especializada en PHAs ( Daniel et al., 1992; Quagliano y Miyazaki, 1996 ) demuestra que este criterio de clasificación, específico para el poli-β-hidroxibutirato (PHB), polímero de cadena corta de 3 a 5 átomos de carbono, no se ajusta a los resultados más actualizados sobre este género bacteriano, ya que el mismo se caracteriza por acumular PHAs de cadenas medias (C6 a C14), aunque bajo determinadas condiciones ambientales y genéticas son capaces de producir el homopolímero (PHB) y el copolímero (PHB-co-PHV), (Steinbuchel et al., 1992), lo cual evidentemente sustenta estos resultados.


Cuantificación de los niveles

de producción de PHAs.


La producción de PHA por las distintas cepas se muestra en la Figura 1. Los niveles de producción del polímero no presentaron diferencias significativas entre las cepas estudiadas.

Tabla I. Fluorescencia relativa de las cepas de origen marino cultivadas en medio con Rojo Nilo (MRN)

a 30 ± 2ò C y reveladas a = 365 nm.


Cepa de bacteria

Tiempo de observación (h)

12 24 36 48 72

Escherichia coli

0

0

0

0

0

Pseudomonas mendocina (# 4)

+

+++

+++

+++

++

“ “ (#5)

0

++

++

++

++

Pseudomonas fluorescens (#6)

0

++

++

++

++

Bacillus thuringiensis (#1)

0

0

0

0

0

Bacillus cereus (#63)

0

+

++

++

+

Bacillus thuringiensis (#66)

+

+

+

+

+

Bacillus cereus (#223)

0

0

0

0

0

Leyenda:

(0)= no fluorescencia, (+)= fluorescencia rosada tenue, discernible del control;

(++)= fluorescencia rosada evidente; (+++)= fluorescencia rosada brillante.



Figura 1.- Producción de Polihidroxialcanoato por cepas de Pseudomonas y Bacillus en Medio Control, en condiciones de cultivo agitado (72 r.p.m.) y temperatura 30 ± 2ºC).


Tabla II. Dinámica del crecimiento en medio líquido agitado (Medio de Control).

70 rpm, 30 ± 2º C, absorbancia a λ= 600 nm..



Cepa bacteriana

A600

24 h 48 h 72 h

Pseudomonas sp # 4

0,21

0,21

0,22

Pseudomonas sp # 5

0,19

0,18

0,13

Pseudomonas sp # 6

0,07

0,11

0,12

Bacillus sp # 63

0,06

0,09

0,19

Bacillus sp # 66

0,10

0,18

0,12



Los resultados del crecimiento, Tabla II, nos indican dos comportamientos diferentes. En primer lugar los cultivos de las cepas 4 y 5 de Pseudomonas mendocina son de rápido crecimiento y ya a las 24 hrs de cultivo se encuentran en plena fase estacionaria. En estas condiciones, la síntesis del polímero pudiera estar asociada a un estadio fisiológico donde la ausencia de crecimiento con exceso de carbono permitiría una mayor disponibilidad de acetil-CoA para ser dirigido a la biosíntesis del polímero. Resultados similares que avalan lo anterior fueron obtenidos por Lee et al., 1996 con una cepa recombinante de Escherichia coli productora de PHB. Las restantes cepas estudiadas aunque muestran un crecimiento lento, el exceso de fuente de carbono facilita niveles del intermediario, acetil Co-A, precursor del polímero.

Influencia de las sales


De acuerdo con el hábitat, las comunidades microbianas responden de una u otra forma a determinados factores. Considerando el ecosistema marino del cual fueron aisladas las bacterias en estudio, se determinó la influencia de las sales en un medio compuestos por nutrientes en agua destilada y en agua de mar natural a la cual se le adiciono nutrientes.



Figura 2. Producción de Polihidroxialcanoato por cepas de Pseudomonas y Bacillus en medio Agua de Mar Natural,

en condiciones de cultivo agitado (72 r.p.m.) y temperatura de 30± 2ºC


Tabla III. Dinámica del crecimiento en medio líquido agitado (Medio Agua de Mar Natural). 70 rpm,

30 ± 2º C, absorbancia a λ=600 nm..



Cepa bacteriana

A600

24 h 48 h 72 h

Pseudomonas sp # 4

0,29

0,63

0,40

Pseudomonas sp # 5

0,38

0,73

0,64

Bacillus sp # 63

0,32

0,43

0,51

Bacillus sp # 66

0,24

0,65

0,66



En la Figura 2 se ilustran los resultados de la producción de PHA en el medio AMN, condiciones que permitieron obtener los mayores niveles de producción. No se encontraron diferencias significativas entre las cepas de Pseudomonas sp para cada uno de los tiempos muestreados, mientras que la cepa 63 (Bacillus cereus), difiere significativamente de la cepa 66 (Bacillus thuringiensis) a las 48 horas de cultivo. La Tabla III muestra como el incremento celular en este medio de cultivo es mayor al compararlo con los resultados del medio control (Tabla II).

Las bacterias marinas crecen bien en concentraciones de NaCl entre 2,5 y 4%, la concentración promedio de sal en el mar es de 3.5 % ( Miravet, 1996), concentraciones que son garantizadas en el medio de cultivo con agua de mar natural (AMN). Esta condición puede haber favorecido un incremento en la síntesis de los biopolímeros, contrario a lo que ocurre en el MC, donde la concentración de sales es del 0,35%, no favorecedora de una actividad fisiológica adecuada para alcanzar niveles de producción del polímero iguales o superiores al medio AMN.

Si tenemos en cuenta lo anterior, la formación de biomasa celular puede estar favorecida por la presencia de otras sales inorgánicas en el medio de cultivo, las cuales en general juegan un papel esencial en el metabolismo celular, como cofactores de reacciones enzimáticas y en la energética celular.
Otros factores no medidos pueden también influir como la presencia de materia orgánica disuelta (MOD) y de precursores de PHA en los océanos. Los componentes predominantes en la MOD en ambientes acuáticos no contaminados son: biopolímeros, polisacáridos y ésteres organofosfóricos, los cuales pueden llegar a constituir las fuentes nutricionales más importantes para estas bacterias (Crost y Rai, 1992) .
La posible presencia de estas fuentes carbonadas en el agua de mar natural, sumada a los 10 g.L-1 de glucosa que contiene el medio de cultivo, puede provocar una glicólisis acelerada, lo que produce la acumulación de alguno de los intermediarios que intervienen en la biosíntesis del polímero como piruvato. Este daría lugar a un exceso de acetil-CoA con un consecuente desbalance en poder reductor (NADH / NADPH), lo cual ha sido informado por Henderson y Colen (1997).
El ecosistema marino presenta frecuentemente contaminación por petróleo así como por sus hidrocarburos, alcanos de cadenas ramificadas entre los que se incluyen los n-alcanos como los más abundantes. Estos compuestos constituyen sustratos relacionados para la biosíntesis de PHA (Mobley, 1994) y en nuestras condiciones experimentales pudieran actuar como precursores y ser incorporados directamente al polímero, o ser degradados por una ruta metabólica alternativa como la ß-oxidación, hasta dar acetil-CoA. Este puede dirigirse hacia el ciclo de Krebs o hacia la síntesis de estos materiales de reserva. Por esta vía Pseudomonas oleovorans es capaz de degradar alcanos para producir β-hidroxil-CoA, sustrato de la PHA sintasa, enzima que participa en la etapa final de la biosíntesis de PHAs (Steinbuchel et al., 1992)


Otras especies de Pseudomonas, con el empleo de estos tipos de hidrocarburos en la biosíntesis de PHA, produjeron, a partir de octanoato, ß-hidroxibutirato (C4), ß-hidroxihexanoato (C6), ß-hidroxioctanoato(C8) y ß-hidroxidecanoato (C10) en una proporción de 1:15:75:9. (Ramsay et al., 1991).

Efecto de la fuente de nitrógeno

sobre la biosíntesis de PHA.


La limitación de nitrógeno en el medio de cultivo es una de las causas que favorecen la biosíntesis de estos polímeros, ya que al producirse desbalance nutricional la síntesis de proteínas y el metabolismo celular se ven impedidos (Lee, 1996).
Los resultados obtenidos en nuestro experimento dirigido a obtener esta situación nutricional se muestran en las figuras 3 y 4, donde se observa que la síntesis de PHA fue posible con cada una de las fuentes de nitrógeno estudiada, para los dos microorganismos seleccionados. La cepa 4 de Pseudomonas mendocina mostró el mayor nivel de producción con el extracto de carne a las 72 horas. Para el resto de las fuentes a los diferentes tiempos no se obtienen diferencias significativas (Fig. 3).
Bacillus cereus (cepa 63), no presentó diferencias en el análisis estadístico para ninguna de las fuentes de nitrógeno, aunque la producción se vio favorecida al emplear extracto de carne (Fig. 4) . Al comparar la producción de PHA entre ambas cepas, la producción por la cepa 4 fue estadísticamente superior.
Estos resultados contrastados con los obtenidos al emplear el medio AMN (Fig. 2) el cual contiene en el Caldo Nutriente las tres fuentes de nitrógenos, se evidencia que la mezcla de peptona, extracto de levadura y extracto de carne resulta más efectivo sobre la síntesis del PHA, lo cual garantiza mayor concentración de nitrógeno, por lo que podemos inferir entonces que en nuestras condiciones no se requiere de limitación de este nutriente para la síntesis de PHA.
Similares resultados fueron obtenidos con la adición de mezclas de fuentes complejas de nitrógeno en la producción de PHB por una cepa recombinante de Escherichia coli (Lee y Chang, 1992).


Figura 3- Influencia de la fuente de nitrógeno sobre la producción de Polihidroxialcanoato en la cepa 4 de Pseudomonas mendocina. Medio Agua de Mar Natural, cultivo agitado (70 r.p.m., 30 ± 2º C).

Figura 4.- Influencia de la fuente de nitrógeno sobre

la producción de Polihidroxialcanoato en la cepa 66

de Bacillus thuringiensis. Medio Agua de Mar Natural,

cultivo agitado (70 r.p.m., 30 ± 2º C).


Efecto de diferentes fuentes de carbono sobre la producción de PHA.


Numerosas sustancias no relacionadas han sido probadas como fuentes de carbono en diferentes especies bacterianas productoras de PHAs (Steinbuchel, 1991).
Para éste estudio se seleccionó la cepa 4 de Pseudomonas mendocina por presentar una acumulación más temprana del polímero, además de tener mejores características de crecimiento y mejores resultados en cuanto a rendimientos PHA · biomasaֿ¹. Los resultados se muestran en la Tabla IV. El PHA fue producido en todas las variantes probadas, y la glucosa resultó ser la fuente de carbono más eficiente, ya que presento diferencias significativas con los demás sustratos carbonados para la producción del polímero, los que no difieren entre sí.

Tabla IV. Influencia de la fuente de carbono sobre la velocidad de crecimiento

(μ, h-1) y producción de Polihidroxialcanoato (mg.L-1) por la cepa 4 de Pseudomonas mendocina

en condiciones de agitación (70 r.p.m.) y 30 ± 2º C.


Fuente de

Carbono

PHB (mg . L-1 )

24 h 48 h 72 h

max

(h-1)

#

átomos

carbono

Glucosa

129,9  6

599,2  22 a

374,0  21

0,1421 0,002

6

Succinato

29,0  2

39,1  8 c

43,4  12

0,0099 0,001

4

Lactato

17,1  1

24,1  6 c

28,3  6

0,1020 0,003

3

Ácido láctico

51,5  7

78,0  9 b

5,0  5

0,1014 0,002

3

Glicerol

24,1  2

21,4  3 d

12,4  4

0,1040 0,002

3

Fructosa

16,2  2

14,3  5 e

23,1  6

0,0966 0,001

6

Xilosa

20,4  3

16,5  5 e

12,5  4

0,0978 0,001

5



Estos resultados pueden estar dados por el mecanismo de transporte de la glucosa en esta cepa, que de alguna manera favorece su entrada más rápida y eficiente a la célula.
Henderson y Colen (1997), informaron que durante la producción de PHB a partir de glucosa por Alcaligenes eutrophus, el azúcar entra a la célula por un sistema de transporte aún no identificado, es catabolizada por la vía Entner-Doudoroff y el complejo piruvato-deshidrogenasa genera dos moléculas de acetil-CoA, justificando la mayor producción con esta fuente carbonada. Esta situación puede ser similar para la cepa en estudio.
En este trabajo se confirma que bacterias de origen marino poseen similares potencialidades en cuanto a la producción de PHAs con respectos a bacterias aisladas de otros ecosistemas, las que han sido mucho más informadas en la literatura consultada. ( Lasala et al., 2000; Martínez et al., 2000; Martínez et al., 2001)




Referencias



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Recibido: Octubre 2001
Aceptado: Marzo 2002


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