Programa de Maestría y Doctorado en Ciencias Bioquímicas




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Represión Catabólica


Cap. 13. Global Regulation: Regulons and Stimulons. Hasta la pag. 558.

Sistemas globales de regulación

Asimilación de nitrógeno (sigma 54)

Regulación por choque térmico (sigma H, sigma E)

Regulación de síntesis de ribosomas y control estricto (sigma S)

Regulación post-transcripcional.

Cap. 13. Global Regulation: Regulons and Stimulons. Hasta la pag. 602.



TEMA VII.

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GENÉTICA EN EUCARIOTES

Dr. Felix Recillas Targa


(4 sesiones)
La regulación de la expresión genética en eucariotes representa uno de los temas centrales en el entendimiento del control de la transcripción de un gen en tiempo y espacio para lograr el desarrollo de un organismo. En la actualidad son variadas las evidencias que demuestran múltiples niveles de regulación para que un gen pueda ser expresado. Son básicamente cuatro los niveles de regulación que discutiremos en esta sección del curso.


  1. Para lograr la expresión coordinada de un gen, múltiples elementos de regulación deben ser atraídos y preparados para inducir el proceso de transcripción. Para lograr esto, se requiere de componentes basales y factores generales de transcripción que permitan reclutar de manera específica, las distintas polimerasas y lograr el inicio regulado de la transcripción. Además de la acción de estos factores es necesario el remodelaje de la estructura de la cromatina para permitir el acceso de la maquinaria basal de transcripción (factores generales (TFs; TAFs; etc.), a las secuencias blanco. Finalmente veremos que estos procesos serán coordinados en parte, por elementos de regulación que dictarán el tiempo, tejido y niveles de expresión de un gen.

  2. Aparentemente la maquinaria basal de transcripción no es suficiente para alcanzar niveles óptimos de expresión de un gen. Son necesarios otros elementos de regulación conocidos como promotores, enhancers (aumentadores), silencers, para complementar dicha regulación. Además, recientemente se han descubierto otro tipo de elementos denominados “Locus Control Region” (LCR) que contribuyen a la expresión de un gen o grupo de genes (por ejemplo en el grupo de genes -globina de humanos y ratón) mediante la formación de una estructura óptima de la cromatina.

  3. Los elementos de regulación antes mencionados son funcionales gracias a la interacción de factores peptídicos, conocidos como factores de transcripción, que al tener contacto con el DNA o con otras proteínas favorecen la activación o represión de un gen.

  4. Durante muchos años la expresión de un gen se consideró como un evento lineal donde su contexto nuclear y de organización no se tomaba en cuenta. Hoy en día la regulación de la expresión genética no puede ser entendida si no se toma en cuenta la estructura de su cromatina. Se piensa que la cromatina constituye uno de los niveles iniciales de regulación que influye en procesos celulares tales como la transcripción, la duplicación, reparación y recombinación del DNA. Finalmente y con el afán de integrar toda la información anterior, presentaremos el concepto de dominio, unidad funcional en el cual se llevan a cabo todos los procesos de regulación antes mencionados.


Objetivo particular: el alumno analizará y discutirá los mecanismos más conocidos de regulación de la expresión genética en eucariotes, asociando esta información con los mecanismos discutidos en los temas anteriores.



Primera sesión

I. Generalidades

¿Qué es el genoma eucarionte?

Organización de un gen

RNA’s

Clasificación de las distintas polimerasas

II. Polimerasas

RNA polimerasa I

RNA polimerasa II

Segunda sesión

RNA polimerasa III

III. Elementos de Regulación

Promotores

Enhancers-Silencers

LCR

Seminario

Tercera sesión

IV. Factores de Transcripción

V. Estructura de la cromatina

Nucleosomas

Acetilación-desacetilación, metilación, fosforilación e ubiquitinización

LCR-sitios de hipersensibilidad

Metilación

Centrómeros y telómeros

Cuarta sesión

VI. Estructura de la cromatina

Secuencias tipo MAR

Dominios

VII. Núcleo, cromatina y transcripción


Literatura de consulta

Lewin, B. (2002) Genes VII. Oxford University Press, N.Y.

Orphanides, G., Lagrange, T., Reinberg, D. (1996) The general transcription factor of RNA polymerase II. Genes Dev. 10:2657-2683.

Hampsey, M., Reinberg, D. (1999) RNA polymerase II as a control panel for multiple coactivator complexes. Curr. Op. Genet. Dev 9:132-139.

Blackwood, E.M., Kadonaga, J. T. (1998) Going to distance: a current view of enhancer action. Science 281:60-63.

Higgs, D.R. (1998) Do LCRs open chromatin domains? Cell 95:299-302.

Bulger, M., Groudine, M. (1999) Looping vesus linking: toward a model for long-distance gene activation. Genes Dev. 13:2465-2477.

Strahl, B.D., Allis, C. D. (2000) The language of covalent histone modifications. Nature 403:41-45.

Singal, R., Ginder, G.D. (1999) DNA methylation. Blood 93:4059-4070.
TEMA VIII.

TÉCNICAS DE DNA RECOMBINANTE
Dr. Juán Miranda Ríos

(4 sesiones)
Objetivo particular: el alumno revisará los fundamentos y aplicaciones de las técnicas modernas de Biología Molecular utilizadas para el estudio de la estructura del genoma y de la expresión genética.

Métodos de enseñanza-aprendizaje: El profesor expondrá algunos aspectos básicos. Cada alumno revisará con detalle una técnica de este programa, consultando diferentes libros, manuales prácticos y catálogos y lo presentará en clase en 10-15 minutos. El número de técnicas que se revisen en este tema se ajustará de acuerdo al número de estudiantes del curso. La presentación deberá incluir los fundamentos teóricos de la técnica, los pasos más relevantes en el desarrollo de la misma y algunos ejemplos de aplicaciones prácticas. La presentación deberá hacerse con métodos audiovisuales que permitan una explicación rápida, eficiente y clara. El alumno entregará además, un breve resumen (no más de dos páginas) de cada tema, a cada uno de los compañeros del curso. Además del resumen impreso, entregarán al profesor una copia de las presentaciones y el escrito en archivos digitales.
Organización de los contenidos: Dado que el estudio de técnicas es un tema árido, este programa fue diseñado con la idea de revisar las técnicas en función de la información que proporcionan sobre sistema biológico en estudio. Una misma técnica puede emplearse en diferentes aspectos, sin embargo, para hacer esta revisión más didáctica, cada técnica se revisa con un objetivo en mente.

Por otro lado, la organización de los temas presenta una secuencia en la que la información que se revisa primeramente, sirve de base para lo que se presenta en los siguientes temas. Por lo tanto, es importante que cada alumno comprenda lo que se revisa en la técnica anterior para que no lo repita en su presentación. Otro aspecto importante es que dada la cantidad de técnicas a revisar en el programa y el escaso tiempo con que contamos, es necesario preparar un buen material audiovisual para la presentación de los temas. Las presentaciones deberán ser preparadas en Power Point. Es importante que se aseguren que la presentación no tendrá problemas en ser exhibida en el sistema audiovisual, ya que en algunos casos existe incompatibilidad entre los sistemas de creación y exhibición. Por último, es importante tener perfectamente claros los conceptos a presentar para hacerlo de una manera efectiva.
Evaluación: La evaluación de este tema se basará en la calidad de las presentaciones orales (considerando tanto las imágenes, así como la claridad en la explicación de los conceptos y fundamentos de las técnicas) y en los resúmenes escritos de los temas que presentaron oralmente (40%), así como en un examen escrito en el que se evaluará la capacidad de aplicar las técnicas que se revisaron en clase, en la resolución de problemas (60%).



Primera sesión.

I. Introducción, reacciones básicas y vectores moleculares


  1. Objetivos del análisis de genes.

  2. Herramientas bioquímicas que se emplean en Biología Molecular.

  1. Enzimas que actúan sobre ácidos nucléicos. Endonucleasas. DNA polimerasas. DNA ligasa. Fosfatasas y cinasas.

  2. Construcción de moléculas de DNA recombinantes.

  3. Vectores moleculares i) derivados de plásmidos, ii) derivados de fagos Lambda.

  1. Nuevos sistemas de clonación de DNA. Gateway technology, Topo cloning technology.


Segunda sesión.

II. Colección y almacenamiento del genoma de un organismo


  1. Bibliotecas de DNA recombinante

  1. Consideraciones generales en la construcción de bibliotecas genómicas y de cDNA. Utilidad de cada tipo de biblioteca

  2. Sistemas biológicos para la contención de bibliotecas: fagos, bacterias, BACs y YACs. Características, ventajas y desventajas de cada sistema

  3. Generalidades sobre BACs y YACs.

  1. Construcción de bibliotecas genómicas

  1. Extracción y purificación de DNA genómico

  2. Preparación de los fragmentos a clonar en la biblioteca

  3. Clonación de las moléculas recombinantes y transformación en bacterias o empaque en cabezas de fagos.

  4. Diferentes sistemas comerciales para construir bibliotecas genómicas

  1. Construcción de bibliotecas de cDNA

  1. Preparación de RNA total y mRNA poli A+

  2. Estrategias empleadas por los distintos sistemas comerciales (Lambda ZAP (Stratagene), SMART (Clontech), CloneMiner (Invitrogen)) para sintetizar cDNA a partir de RNA mensajero y su clonación en vectores moleculares.

  3. Ventajas y desventajas de los distintos sistemas

III. Aislamiento, identificación y caracterización de genes


  1. Aislamiento de genes de una biblioteca

  1. Escrutinio de bibliotecas de fagos por hibridación con sondas de ácidos nucléicos (Southern blot)

  2. Preparación de sondas de DNA por marcaje radioactivo y no radioactivo

  3. Escrutinio de bibliotecas de expresión empleando anticuerpos (técnica de Western blot)

  1. Reacción en cadena de la polimerasa

  1. Diseño de primers

  2. Condiciones para conseguir amplificaciones exitosas

  3. Diferentes estrategias para clonar genes empleando PCR


Tercera sesión.

  1. Identificación de la secuencia aislada

  1. Secuenciación de ácidos nucleicos por el método de Sanger y secuenciación automatizada empleando nucleótidos acoplados a fluoróforos

  2. Comparación con secuencias reportadas en el GeneBank (Blast Search)

  3. Demostración de que el gen que aislaste realiza la función propuesta (pruebas de complementación en mutantes)

IV. Estudio de la expresión genética.


  1. Determinación de la secuencia completa del RNA mensajero

  1. Primer extension 5' RACE

  2. Primer extension 3' RACE

  1. Síntesis/degradación de RNA (introducción)

  1. Determinación de velocidades de transcripción (run off/run on)

  2. Degradación de RNA

  1. Expresión tejido/desarrollo/condición específica

  1. Diferential Display

  2. Microarrays

  3. RT-PCR

V. Regulación de la expresión genética


  1. Estudio de los factores en cis (secuencias)

  1. Uso de genes reporteros para medir actividad de promotores

  2. Introducción de DNA a células eucarióticas: transfección, electroporación, bombardeo, uso de Agrobacterium tumefasciens

  1. Factores en trans (proteínas)

  1. Interacciones proteína-DNA. Gel shift.

  2. Mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción a promotores.

  3. Interacciones proteína-RNA. Transcripción in vitro. UV. Crosslinking

  1. Interacciones proteína-proteína. Sistema de doble híbrido


Cuarta sesión.

VI. Producción de proteínas recombinantes


  1. Escherichia coli

  1. Promotores/sistemas empleados para controlar la inducción de proteína recombinante

  2. Producción de proteínas de fusión (Maltose binding protein, Gluthathione-S-transferase) c-Myc y con etiquetas de Histidinas (pQE System)

  1. En sistemas eucariotes

  1. Baculovirus

  2. Levaduras (Picchia pastoris)

VII. Análisis de la función de productos génicos (proteínas)


  1. Mutagénesis dirigida: función de aminoácidos conservados y dominios protéicos

  2. Gene targeting (knockout)

  3. Gene silencing (RNA de interferencia)

  4. Tecnología antisentido en plantas

IX. Descubriendo la localización de los productos génicos


  1. Hibridación in situ

  2. Proteína verde fluorescente (GFP): herramienta para la determinación de la localización sub-celular y otros usos

  3. Empleo de etiquetas para determinar la localización sub-celular

X. Análisis de sistemas


  1. Genómica

  2. Metagenómica

Proteómica



Literatura de consulta

Se recomienda buscar y consultar las ediciones más recientes de diversos libros de texto sobre técnicas. En estos textos se pueden conocer los fundamentos de las técnicas. Sin embargo, dados los rápidos cambios que se suceden en la tecnología del DNA recombinante, es determinante que revisen los catálogos de compañías que venden productos para la investigación en esta área. Entre las principales compañías están: Stratagene, Invitrogen, Clontech, Bio-Rad, New England Biolabs, Promega y otras, las cuales poseen tecnología propia para las diferentes aplicaciones y se han vuelto esenciales en los laboratorios de investigación. Por lo tanto, en la mayoría de los casos, la presentación de la técnica deberá prepararse a partir de las tecnologías descritas en los catálogos o sitios electrónicos de las diversas compañías para presentar la tecnología más reciente que se emplea en el campo.


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