En clase de cmc de 1º De Bachillerato, los alumnos realizan la secuenciación de un genoma. Mientras un grupo de alumnos propone una secuencia cualquiera de un genoma, otro grupo –simulando realizar las técnicas de secuenciación- averigua la secuencia correcta propuesta por sus compañeros

TOMAGENOMA V: Secuenciando Genomas En clase de CMC de 1º De Bachillerato, los alumnos realizan la secuenciación de un genoma. Mientras un grupo de alumnos propone una secuencia cualquiera de un genoma, otro grupo –simulando realizar las técnicas de secuenciación- averigua la secuencia correcta propuesta por sus compañeros. Se describe a continuación la actividad con un ejemplo concreto y sencillo con el fin de seguir los pasos con más detalle. Previamente se divide el grupo de alumnos en dos. El grupo I es el que escribe la secuencia genómica a su gusto con una extensión de varias decenas de pares de bases. El grupo II intentará averiguar el orden de la secuencia propuesta por sus compañeros simulando los procesos técnicos que se realizan en el laboratorio para secuenciar genomas. 1.- El Grupo I de alumnos escribe sobre un papel cuadriculado la secuencia que deseen y que representa el genoma completo. (Figura 1). (1) 2.- A petición del grupo II de alumnos, los del grupo I reproducen la misma secuencia en otro papel cuadriculado, a ser posible con diferente color de fondo (Fig 2). (2) 3.- A petición del grupo II, los alumnos del grupo I, cortan transversalmente la primera copia del genoma en varios trozos. Les piden que también lo hagan igualmente con la segunda copia del genoma pero por otros lugares distintos. (Figuras 3.a y 3.b). (3) 4.- Solicitan, a continuación, que de cada uno de los fragmentos obtenidos, escojan una cualquiera de las dos hebras de los fragmentos resultantes de cada corte y las escriban por separado. (Figuras 4.a y 4.b). (4) Ni qué decir tiene que todas las acciones anteriores realizadas por el grupo I deben ser ejecutadas sin desvelar los detalles a los alumnos del grupo II. Llegados a este punto podemos decir que se han realizado los prolegómenos de la técnica de la secuenciación. A partir de aquí, se pueden seguir 2 modalidades técnicas: secuenciar cada fragmento por separado (véase nota al final de este trabajo), o todos ellos conjunta y simultáneamente. Nosotros simulamos realizar esta última modalidad por ser más rápida. Se denomina ultrasecuenciación. Para la ultrasecuenciación, se utilizan en el laboratorio los Biochips de ADN (denominados también Microarrays). Consisten en un soporte bidimensional de material sólido que se encuentra dividido en multitud de cuadrículas o puntos. En cada cuadrícula, punto o posición del mismo y mediante técnicas especiales, se coloca un fragmento de ADN de una sola hebra diferente en cada uno. Para el caso que nos ocupa – la secuenciación- se colocan los fragmentos del primer corte en posiciones distintas de aquellas ocupadas por fragmentos del segundo corte de forma que puedan diferenciarse unas de otras. Cada punto o posición del biochip está ocupado, por tanto, por una de las hebras de un fragmento diferente obtenidos del apartado 4. En un biochip real y secuenciando genomas reales –que son muy largos- pueden existir hasta decenas de millares de cuadrículas, puntos o posiciones para otros tantos fragmentos resultantes. 5.- Se representa, por tanto, nuestro biochip -más modesto- de sólo 7 puntos ( 4 y 3 correpondientes a los fragmentos de uno y otro corte de nuestro ejemplo) por 7 mesas de clase ocupada cada una por un alumno del grupo I . Cada alumno del grupo I tiene en sus manos, sobre su mesa, una hebra de su correspondiente fragmento y representará lo que vaya sucediendo en cada punto concreto del biochip. El biochip por tanto se convierte en una especie de laboratorio de multiensayos. Antes de comenzar la simulación de ensayos propios de la secuenciación, los alumnos del grupo I deben indicar al otro equipo qué mesas tienen un fragmento del primer corte realizado y cuales tienen fragmentos del segundo corte. Estos últimos se preparan para anotar los ensayos que ocurrirán posteriormente en cada una de las posiciones del biochip; es decir, para registrar lo que vaya ocurriendo en cada una de las mesas. (Figura 5). (5) Nota: aunque en las figuras que siguen se observa conjuntamente las acciones del grupo I y II, ambos grupos realizan su acción por separado. Preparado el biochip continuamos con el proceso. 6.- Ahora los alumnos del grupo II simulan que inician la secuenciación repartiendo nucleótidos de Adenina y sólo de adenina por todo el biochip a los alumnos del grupo I ocupantes de las 7 mesas. Estos últimos indican si la adenina se ha incorporado o no –iniciando o no la formación de la hebra complementaria a la que poseen en cada punto- levantando la mano en caso afirmativo o no haciéndolo si no lo hizo. Además, en caso de que pudieran colocarse varias adeninas seguidas, se levanta la mano tantas veces como incorporaciones se hayan producido. Los alumnos del grupo II anotan las incorporaciones de adenina según la posición de cada mesa. (Figura 6). (6) 7.- Los alumnos del grupo II simulan ahora el reparto de nucleótidos de timina y solo de timina por las mesas. Los alumnos de la mesas en que se haya incorporado la timina en su secuencia levantan el brazo para indicarlo y de nuevo tantas veces como incorporaciones posibles. Los alumnos del grupo II anotan las incorporaciones y su número en cada mesa. (Figura 7). (7) 8.- Repetimos la misma acción con nucleótidos de guanina y sólo de guanina. (Figura 8). (8) 9.- Lo mismo con nucleótidos de citosina y sólo de citosina. (Figura 9). (9) 10.- Se vuelve a repetir de nuevo el ciclo de reparto A, T, G, C (Figuras 10,11,12 y 13) . Se realizarán tantos ciclos de reparto como sean necesarios hasta finalizar las hebras complementarias de todos los fragmentos. Los alumnos del grupo II se darán cuenta de ello cuando exista una serie completa en el reparto de nucleótidos (A,T,G,C; T,G,C,A,; G,C,A,T o C,A,T,G ) en la que nadie ha levantado la mano y por lo tanto no ha sido posible la incorporación de ningún nucleótido porque la hebra complementaria ha finalizado. (Figura 14). (10) 11.- Con los datos anotados por los alumnos del grupo II de lo ocurrido en cada mesa determinan la secuencia complementaria elaborada de cada hebra y con ella la secuencia genómica original de cada fragmento. Construyen por tanto la secuencia del ADN de cada fragmento. Conocen además, por la posición de las mesas que ocupaban, qué 3 trozos forman el genoma completo y qué 4 trozos forman también el mismo genoma completo. (Figura 15). 12.- Lo que les queda finalmente por realizar es hacer corresponder el orden en que irían colocados los fragmentos para la resolución correcta de toda la secuencia genómica. Para ello sólo se trata de buscar secuencias iguales entre los trozos de uno y otro color (de un corte y otro) hasta hacerlos corresponder totalmente. Una estrategia sencilla para ello es comenzar con el fragmento secuenciado más largo. Se busca, a continuación un fragmento del otro corte cuya secuencia coincida en parte con la secuencia del largo fragmento anterior. Colocamos ambos en paralelo con su secuencia coincidente. Buscamos otros fragmentos coincidentes en secuencias de uno y otro corte hasta una correspondencia total. Se tendrá finalmente secuenciado el genoma. ( Secuencia de Figuras 16). (11) Representa el genoma a secuenciar. Representamos las 2 hebras de ADN con las letras iniciales de los nucleótidos. Lo hacemos, además, en minúscula para diferenciar mejor las letras. Representamos la segunda hebra de forma invertida en la parte superior para indicar la dirección 5’ – 3’ haciendo coincidir ésta con el sentido de la escritura-lectura; es decir, con el sentido natural de incorporación de nucleótidos para la formación y crecimiento de las cadenas del ADN. Lógicamente, en la realidad, los genomas o fragmentos de genoma a secuenciar son extraordinariamente más largos. No obstante, para comprender el proceso de secuenciación , nos valemos de uno mucho más corto como muestra y modelo. El proceso de secuenciación necesita que el preparado en la extracción y obtención del genoma de la muestra del tejido biológico de donde se consigue, se divida en 2 fracciones o partes. En nuestro caso, lo hacemos con distinto color de fondo para facilitar la distinción entre los fragmentos resultantes del siguiente paso y que sea más fácil distinguirlos y no equivocarse. En las técnicas reales de secuenciación, este paso se realiza por la acción de enzimas de restricción: tijeras bioquímicas específicas que cortan transversalmente el genoma en lugares donde existen secuencias especiales con características de palíndromos. Se utilizan 2 tipos de tijeras diferentes para cada uno de los cortes. A efectos didácticos –nuestro caso- esa circunstancia no es importante y por ello los alumnos realizan los cortes donde quieren en ambos casos, con tal de que no coincidan los puntos por los que se secciona transversalmente la cadena de ADN del genoma. Con técnicas de desnaturalización del ADN (calor, pH,..) separamos ambas cadenas. Posteriormente, diferentes técnicas permiten quedarnos con una de las hebras de cada fragmento y desechar o anular la otra. La selección de la hebra concreta se realiza al azar en el laboratorio. En unos casos se seleccionará el fragmento de la hebra superior y en otros de la inferior. Es necesaria aclarar que en las técnicas reales de laboratorio, las hebras se fijan al sustrato del biochip por el extremo 3’. Si éste quedara libre, en los sucesivos pasos a realizar la hebra continuaría creciendo por ese extremo y no se formaría la complementaria que es el objetivo que persigue la secuenciación. Como es sabido, los nucleótidos al formar cadenas, solo lo realizan en dirección 5’ – 3’. La adenina sólo podría incorporarse, en caso de poder hacerlo, en el inicio de la cadena complementaria a la ya existente. La incorporación de un nucleótido a la cadena se produce en el laboratorio mediante una serie de reacciones químicas en las que intervienen nucleótidos “preparados”, junto con otros reactivos que originan finalmente una sustancia luminiscente si se produce incorporación. En cambio, la luminiscencia no se produce si no ha habido incorporación del nucleótido a la cadena. Existen técnicas de secuenciación que sólo permiten la incorporación de un solo nucleótido por turno ya que dichos nucleótidos de laboratorio están modificados químicamente además en su posición 3’ para que no se pueda prolongar la cadena –en el caso de que se pudiera- más que solamente de uno en uno. Por el contrario, otras técnicas permiten que se acoplen varios seguidos produciendo una señal luminiscente de doble, triple o cuádruple intensidad en función del número de incorporaciones de ese mismo nucleótido. Nosotros lo representamos de este segundo modo. El número de nucleótidos incorporados en cada posición se anunciará por el número de veces que se levanta el brazo. En el laboratorio se procede previamente a un lavado del biochip para arrastar con él a todos los nucleótidos de adenina desparramados sobre él en el punto anterior. Sólo quedarán aquellos que se hayan colocado pegados por complementariedad a las hebras fijadas en el biochip. Otra vez lavado previo de la timina a la incorporación de la guanina. Con lavado previo de la guanina a la incorporación de la citosina. Las anotaciones que los alumnos del grupo II van haciendo de las incorporaciones sucesivas de los diferentes nucleótidos se realizan en el laboratorio automáticamente y a gran velocidad mediante un laser lector que “lee” los puntos de luz y su intensidad que se producen en los diferentes posiciones del biochip. Un equipo informático traduce posteriormente la secuencia incorporada en cada punto o posición del mismo. La informática es muy poderosa y reconstruye la secuencia completa también automáticamente aunque para ello tenga que hacer corresponder las secuencias de multitud de fragmentos al mismo tiempo para la secuenciación real en el laboratorio. Nota: En caso de optar por la secuenciación de los fragmentos por separado, se obtendrían los resultados siguientes al realizar la secuenciación y posterior electroforesis de cada fragmento: A.-Resultados de la secuenciación de los fragmentos del primer corte: (Amarillos) Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 Fragmento 4 A T G C A T G C A T G C A T G C 7 9 18 20 6 8 17 19 5 7 16 18 4 6 15 17 3 5 14 16 3 4 13 15 1 3 12 14 2 11 13 1 10 12 9 11 8 10 7 9 6 8 5 7 4 6 3 5 2 4 1 3 2 1 B.- Resultados de la secuenciación de los fragmentos resultantes del segundo corte (azules): Fragmento 1 Fragmento 2 Fragmento 3 A T G C A T G C A T G C 15 18 21 14 17 20 13 16 19 12 15 18 11 14 17 10 13 16 9 12 15 8 11 14 7 10 13 6 9 12 5 8 11 4 7 10 3 6 9 2 5 8 1 4 7 3 6 2 5 1 4 3 2 1

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