Sanz, Marianela1*; Mitchell, Raquel2; Bernasconi, Andrea3; Prieto, Emma4; Danielian, Silvia5; Rossi, Jorge6
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  APORTE DE LA CITOMETRIA DE FLUJO AL ESTUDIO DE SINDROMES HEMOFAGOCITICOS TÍTULO: Autores: Sanz, Marianela1*; Mitchell, Raquel2; Bernasconi, Andrea3; Prieto, Emma4; Danielian, Silvia5; Rossi, Jorge6. Servicio o Área, y sub Áreas 1Servicio de Inmunología y Reumatología. Laboratorio de Inmunología Celular. Hospital de Pediatría Prof. Dr. Juan P. Garrahan. Buenos Aires, Argentina.*E-mail del autor: marianelasanz@hotmail.com El Síndrome Hemofagocítico o Linfohistiocitisis Hemofagocítica (LH) es una patología grave y fatal que se debe a una activación descontrolada de linfocitos T y macrófagos frente a la incapacidad del sistema inmune de generar una respuesta efectiva.  Geneviève de Saint Basile, Gaël Ménasché and Alain Fischer En condiciones normales durante una infección viral el sistema inmune se activa generando una respuesta citotóxica para lograr la erradicación de la célula infectada. Eliminado el patógeno del sistema, la respuesta inmune se autolimita por diferentes mecanismos que incluyen la destrucción de células efectoras por citotoxicidad. La mayoría de las células efectoras mueren, quedando algunas como linfocitos T de memoria. Tanto la eliminación de células infectadas como la autolimitación de la respuesta que se genera utilizan la misma maquinaria citotóxica. Uno de los mecanismos es a través de la perforina, proteína que induce poros en la membrana de la célula blanco, conduciendo a su muerte o apoptosis. En pacientes con LH, frente a la misma infección, se produce una expansión descontrolada de los linfocitos T sostenida por la persistencia de la infección, ya que hay una falla intrínseca en las células capacitadas para erradicar al patógeno. Esto genera una secreción de citoquinas por parte de los linfocitos activados que activan macrófagos, los cuales activan a más linfocitos. Altos niveles de citoquinas inflamatorias son secretadas y generan una respuesta inflamatoria sistémica. Esto lleva a que los macrófagos activados fagociten células (hemofagocitosis) y junto con linfocitos activados infiltren distintos órganos que pueden llevar a la falla del órgano. Clínicamente es una enfermedad no maligna que se caracteriza por fiebre, hepatoesplenomegalia, citopenias y hemofagocitosis en médula ósea, bazo, hígado y ganglios linfáticos. Desde el punto de vista de los parámetros bioquímicos se presenta con hipertrigliceridemia y/o hipofibrinogenemia, ferritina elevada, aumento del receptor soluble de IL-2(sCD25), disminución o ausencia de funcionalidad de células Natural Killer (NK), subpoblación linfocitaria que se encarga de ejercer citotoxicidad. Se conocen formas primarias asociadas a defectos genéticos y secundarias asociada a infecciones, trastornos autoinmunes y neoplasias. Dentro de las formas primarias, se describe la Linfohistiocitisis Hemofagocítica Familiar (LHF), de aparición frecuentemente temprana, determinada por mutaciones en genes de herencia autosómica recesiva. Estos genes codifican para proteínas involucradas en la maquinaria citotóxica que linfocitos T y células NK utilizan para erradicar, por ejemplo, infecciones virales. En base a la proteína involucrada se conocen 4 tipos de LHF, clínicamente indiferenciables: *LHF2 por defectos en perforina, proteína (codificada por gen PRF1) contenida en gránulos citotóxicos de las células citotóxicas y que afecta la formación de poros en la célula que debe ser atacada para ser destruida, por ejemplo, una célula infectada por un virus. *LHF3 por defecto en Munc13-4, (gen UNC13D), *LHF4 por defecto en Sintaxina-11 (gen STX11), *LHF5 por defecto en Munc18-2 (gen STXBP2). Estas 3 proteínas participan en distintos pasos del tráfico de los gránulos secretorios hacia la superficie de las células citotóxicas y permiten que los mismos lleguen a la interfase (sinapsis) entre estas células y la célula blanco para poder liberar su contenido de granzimas y perforinas. Este proceso se conoce como degranulación y al estar defectuoso se impide la liberación normal del contenido de los gránulos a las células infectadas.    Desde el laboratorio se pueden discriminar estas funciones por distintos ensayos. El objetivo de este trabajo es presentar: a) las técnicas inmunológicas que se aplican en el laboratorio de Inmunología Celular para discriminar defectos en la maquinaria citotóxica y decidir una búsqueda molecular para diagnóstico de LH. b) los resultados obtenidos en pacientes con sospecha de LH que fueron estudiados por estas técnicas. Materiales y métodos: Se estudiaron 10 pacientes, 7 de sexo femenino y 3 de sexo masculino, con sospecha de LHF (edad x: 2a; r: 1m-5a). Todas las determinaciones se realizaron en paralelo con una muestra de donante sano como control del ensayo. Los estudios realizados comprenden 1) Ensayo de citotoxidad estándar por liberación de Cr51. La funcionalidad citotóxica de las células NK se determina por la cantidad de Cr51 liberado en el sobrenadante de cultivo luego de 4hs de incubación de células mononucleares de sangre periférica del paciente con células de la línea celular K562, (previamente incubadas con Cr51, de manera que el radioisótopo quede incorporado en la célula y al ser destruída por la célula NK, sea liberado al sobrenadante). La cantidad de cuentas radioactivas en el sobrenadante es proporcional a la cantidad de cromo liberado y está directamente relacionado con la funcionalidad de las células NK presentes entre las células mononucleares del paciente. 2) Técnicas por Citometría de Flujo. Marcación de perforina: detección citoplasmática de la proteína en células NK por anticuerpos específicos post permeabilización de la membrana celular. Ensayo de degranulación para detección de CD107a: El CD107a (LAMP-1) es una proteína asociada en la superficie luminal de los gránulos citotóxicos. Cuando se produce la activación y fusión de los gránulos con la membrana plasmática de la célula NK, LAMP-1 queda expuesta en la superficie celular. De esta manera puede ser detectada por anticuerpos específicos en la superficie de células NK y medida por Citometría de Flujo.  Brevemente la técnica consiste en enfrentar células mononucleares de sangre periférica del paciente con la línea celular K562 (célula activadora) durante dos horas. Posteriormente las células se marcan con anticuerpos para identificar las células NK (CD56) y el CD107a. La expresión de CD107a es indicativa de una degranulación normal. Si las células responden a este estímulo, es decir degranulan, van a expresar CD107a en su superficie. Resultados: Tabla de resultados de ensayos de citotoxicidad NK, expresión de perforina, degranulación (CD107a) y determinación molecular de los genes involucrados en LHF, realizado en 10 pacientes.
N: normal; A: ausente; ND: no determinado; D: descartado; LHF: Linfohistiocitisis Hemofagocítica Familiar. Conclusiones: La actividad NK estaba defectuosa en los cinco pacientes en los que fue medida, cuatro de ellos presentaban defectos en alguna de las proteínas descriptas (2 pacientes con LHF4, 1 paciente con LHF5, y un paciente con LHF2). La ausencia de expresión de perforina medida por Citometría de Flujo permitió llegar al diagnóstico de LHF2 en dos pacientes. Defectos en los mecanismos de degranulación medidos por CD107a fueron encontrados en cuatro pacientes, basado en una baja o casi ausente expresión de CD107a. Esto se correlacionó con mutación en STX11 en dos de ellos y con mutación en STXBP2 y en UNC13D en otros dos. Otros cuatro pacientes presentaron una expresión anormalmente alta de CD107a. En todos se descartó la presencia de mutaciones en los genes implicados en los mecanismos de granulación sugiriendo en estos pacientes el diagnóstico de LH secundaria. El ensayo de CD107a permite discriminar entre los pacientes que deben someterse o no a la búsqueda de mutaciones para Munc13-4, Sintaxina-11 y Munc18-2. La aplicación de estas técnicas inmunológicas resulta útil para diferenciar los mecanismos involucrados en pacientes con LH, orientando así la búsqueda de mutaciones para el diagnóstico molecular. C   ABA – Buenos Aires - ArgentinaE-mail: comisiondetecnicos@garrahan.gov.ar Web: www.garrahan.com.ar/congresos |
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